食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项

食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项食用菌菌种分离的方法和操作步骤
菌种分离即是进行食用菌菌丝纯化的过程，它是制种工作的重要环节，通俗地讲就是把食用菌菌丝从自然中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯食用菌菌丝的过程。

菌种分离是一项重要而又细致的工作，每个环节都必须严格按照无菌操作规程进行。

食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三种。

1.组织分离法
组织分离法是将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。

其特点：一是属于无性繁殖，能够保持原有菌种的优良特性，是生产中获得纯菌种的常用方法，且简单易行，取材广泛，菌丝萌发快。

二是组织分离操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。

但对银耳、黑木耳等胶质菌因其子实体种菌丝极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。

1.1子实体分离种菇要选择朵大盖厚、柄短、八九分成熟的优良品种。

切去菇体基部，在超净工作台用75%的酒精棉球进行擦拭菌盖与菌柄两次，进行表面消毒。

接种时，只要将种菇撕开，用消毒后的小刀在菌柄与菌盖的交界处切取一小块组织，再用接种针将组织块放入PDA培养基的试管斜面中间。

置于24℃温度下培养3-5天就可以看到组织块上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。

如香菇、平菇等可以使用此方法。

1.2菌核组织分离茯苓、猪苓、雷丸等食用菌的子实体不易采集。

而常见的是它储藏营养的菌核。

用菌核分离，同样可以获得菌种。

方法是将菌核表面洗净，用酒精消毒，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA培养基斜面上，在24℃下培养，产生菌丝后进行分离纯化。

应注意的是，菌核是储藏器官，大部分是多糖类杂质，只有少量的菌丝，因此挑选的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分离出菌种。

1.3菌索分离法菌索分离常用于蜜环菌分离。

方法是选新鲜的活菌索，用75%酒精棉球将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀切成小段，接入PDA斜面培养基上，在24℃下培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。

2.孢子分离法
孢子分离法是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体种弹射出
来的原理，在无菌操作条件下，使孢子在适宜的培养基上萌发生长成菌丝体而获得纯菌种的一种方法。

这种菌种生活离强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇实验才能在生产上应用。

其特点一是属于有性繁殖，后代易发生变异，可用此法培育新品种。

二是分离过程较复杂，适用于胶质类和小性伞菌。

孢子分离可分为单孢分离法和多孢分离法。

3.1单孢子分离：取单孢子接种在试管斜面培养基上，让它萌发成菌丝体获得纯菌种的方法。

蘑菇和草菇用单孢子分离得到的菌丝有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。

单孢子分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢子分离法。

3.2多孢子分离：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让他们萌发、自由交配来获得纯菌种的方法。

操作简单易学，生产上经常采用，由于采集孢子的方法不同又可分为一下几种。

①采集器孢子弹射法采集孢子的装置可用玻璃钟罩或者玻璃漏斗做成。

蘑菇和香菇常用这种方法采集孢子。

具体做法是：把玻璃钟罩或漏斗，放在一个垫有几层纱布的瓷盘上，内放培养皿和不锈钢支架，上端气孔用棉花塞住，然后用两层大纱布将整个装置包起来，高压灭菌后，移入无菌室备用。

分离时把选好的种菇，切去菌柄基部送入无菌室用75%的酒精消毒1-2分钟后，用无菌水漂洗，除去表面药液，再用无菌纱布擦手，并将其插到不锈钢支架上，静置1-2天，菌褶上有大量孢子散落在培养基内，形成一层粉末状孢子印时，取下种菇，用灭菌后的用灭菌后的注射器，吸取3~5mL无菌水，注入盛有孢子的培养皿中，轻轻搅动，使孢子均匀地悬浮于水上，再将注射器插上针头，吸取沉于底部的饱满孢子，注1~2滴悬液于试管斜面培养基，并使其均匀分布于培养基表面。

或用接种环挑取少量的孢子直接在斜面培养基上画线。

待抱子萌发，生成菌落时，选孢子萌发快，生长良好的菌落，移接到新的斜面培养基上培养。

②三角瓶悬挂法银耳、黑木耳常用此法采集孢子。

以银耳为例，其具体做法如下:选朵大、雪白、无病虫害的新鲜银耳作为种耳，用75%的酒精棉球擦拭子实体表面，经无菌水冲洗种耳数次后，用无菌滤纸把种耳表面的水分吸干。

用火菌刀把种耳切成一小块，以入瓶后不会碰到瓶壁为度，挂在用火焰灭菌过的小金属钩(或不锈钢钩)上，迅速悬挂在三角瓶内，注意勿使种耳接触到培养基，以防杂菌污染。

塞上棉塞，放在20~25℃条件下，经1~2d，就可看到培养基上形成一
个雾状孢子印。

此时，以无菌操作把悬挂瓶内的耳片取出，再塞上棉塞，移到20~25℃的室中培养，经2~3d，培养基表面就会出现许多乳白色糊状的菌落，就是银耳的分生孢子。

③贴附法按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块，用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、糨糊等贴附在试管斜面培养基正上方的试管壁上。

经6~12h的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即
可。

④褶上涂抹法适用于野外采种，方法简便，效果也好，按无菌操作分离时应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上画线接种。

采用孢子分离要注意控制培养的温度。

因为食用菌孢子的弹射与培养的温度密切相关，如双孢蘑菇孢子弹射最适温度是14~18℃，培养在25℃条件下，孢子就很难弹出。

一般设食用菌孢子弹射的最适温度比菌丝体生长的最适温度低，而与子实体发育的最适温度大致相同。

如香菇孢子弹射的最适温度为12~18℃，银耳为20~24℃，黑木耳为20~26℃，平菇为13~20℃。

孢子分离得到的母种必须进一步提纯复壮，当母种定植一星星期左右菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂菌的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种转管不宜超过5次。

孢子分离得到的母种必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种1后才可供生产使用。

一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。

3.基内菌丝分离法
基内菌丝分离法是利用生长食用菌菌丝的基质作为分离材料进行分离的一种方法。

属于组织分离法中的一种。

在食用菌生产上主要是利用栽培袋(瓶)、菌床培养料、段木等作为基内菌丝分离对象，如果是袋(瓶)的材料，多选用袋(瓶)底部菌丝较幼嫩的部分进行分离。

分离时取一块无污染的菌丝块，在无菌条件下掰开菌丝块，从中挑取绿豆大小、菌丝生长旺盛的菌丝块，移入试管即可。

如果是菌床宜选择内部无污染的菌丝块。

特别是银耳、黑木耳采用这种方法，成功率高，性状也较稳定，是生产上经常采用的方法。

具体做法是从野生或人工栽培的场所选择子实体发生早、生长旺盛、朵大、无病虫害的菇木或耳木，锯取一小段，让其充分风干后备用。

分离时如为香菇的菇
木，先锯取1cm的薄片，切去四周用0.1%升汞水表面消毒1~2min，用无菌刀将其劈成小木片，再切成0.5cm2的小木条，移入试管斜面培养基上，经25~27℃培养，菌丝生长后，再转管培养。

分离时如为银耳的耳木，先从长有子实体部位，锯取1~2cm厚的木片，剔除树皮及耳基，再用0.1%升汞水或70%酒精涂擦表面消毒，通过耳基着生处，把耳木纵切为二，用无菌刀在耳基着生处，削取极小的木屑，移入试管斜面培养基上。

接种后放在20~28℃的温度下培养，数天后接种块的周围开始长出纤细的白色菌丝，延伸到培养基后，培养基的颜色逐渐变黄转黑，表面出现浅灰色斑纹，这就是羽毛状菌丝。

一星期后，小木屑上出现白色短绒毛状菌丝，同时分泌白色或淡黄色水珠，这就是银耳的发育菌丝。

挑取银耳发育菌丝和少许羽毛状菌丝转接于新的斜面培养基上进行扩接，一星期后，菌丝长满试管，即成为母种。

在实际分离中往往不可能得到银耳菌丝与羽毛状菌丝两者兼有的母种。

或纯为银耳菌丝;或纯为羽毛状菌丝;或为酵母状分生孢子，还有相当数量是感染杂菌或不长任何菌丝的。

纯银耳菌丝和纯羽毛状菌丝经适当配合后，就可应用于生产。

黑木耳的耳木分离，其操作方法与银耳大致相同，但不像银耳有多种类型的菌丝。

耳木接入试管后，一般放在22~28℃条件下培养2~3d可见菌丝长出。

选生长健壮、清楚、两端整齐的，进行转管纯化2~3次即可培育成母种。

在培养过程中，有时培养基背面会出现乳白色或淡褐色，这是正常现象，其特点是易感染杂菌。

基内菌丝分离法一般只在下列情况下采用:①子实体已腐烂，但又必须保留该种菌种;②有些子实体小而薄，用组织分离法和孢子分离法较困难;③还有一些菌类如银耳菌丝，只有与香灰菌丝生长在一起才能产生子实体，如果要同时得到这两种菌丝的混合种，也只能采用基内菌丝分离法进行分离。

4.菌种的纯化
一级菌种的纯化是指对分离获得的菌种进行再提纯，成为生产所需要的菌种的方法。

在实践中，无论采用哪种分离方法，都不排除杂菌污染的可能性，如果已确定被污染可以采取以下措施纯化。

4.1菌丝的再提纯
正常的菌种在固体培养基上，菌丝逐渐向四周呈辐射状生长，边缘整齐一致，菌丝浓密健壮。

如果被杂菌污染，则菌丝生长不一，菌落边缘参差不齐，培养基内会产生各种色素，并发出臭味。

如果需要采用
这种菌种，就必须进行再提纯。

再提纯时，可选用菌落生长速度较为一致的菌丝体作为再提纯对象，用消毒的接种铲切取菌丝的前端部分(连同培养基一起)，转移到新的培养基上培养。

如果菌丝生长稀疏，如草菇，也可采用单根菌丝分离法，即在显微镜低倍镜下选择单根菌丝，用锋利的接种针，仔细地将贴在固体培养基上的单条菌丝带小量培养基切下，移到新的培养基中培养。

经过几次的切割移植，逐渐挑选生长良好的无杂菌菌株，从而获得纯菌种。

4.2污染物的排除
在菌种分离后，细菌、霉菌的污染时有发生，必须加以排除。

一般来讲，被杂菌污染的菌株不再使用。

但有时由于菌种紧缺，并且污染物不多，也可用灭菌滤纸浸在1%的多菌灵溶液中，然后取出覆盖于霉菌的生长点上，以防止分生孢子的
扩散，然后用接种铲切取一小块远离杂菌的健壮菌丝移至新的斜面培养基上培养。

如果是细菌污染，细菌的菌落比较局限，并不会出现细胞飞扬现象，因此，可以先用接种铲将细菌菌落连同培养基一起取出来，再从无菌部位取菌丝块转管一次，同样可以获得纯菌种。