高效降解嘌呤核苷乳酸菌的筛选、鉴定及特性研究

发酵科技通讯
Bu l etinofFermentationScienceandTechnology Vol50No1 Mar2021
第50卷第1期
2021年3月
高效降解嘌吟核苷乳酸菌的筛选、鉴定及特性研究
陈沈梁1,张越恺1,李晨欣1,沈诗莹1,吴玲彩1,赵伟睿1,胡升1，梅乐和12
(1.浙大宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江宁波315100'.浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江杭州310027)
摘要：应用具有高效嗥吟核苷降解能力的乳酸菌进行高尿酸血症(HUA)辅助治疗和预防，可以减轻或解除饮食限制对HUA患者生活质量的影响。

采用高效液相色谱法对从泡菜中分离得到的56株乳酸菌的嗥吟核苷降解能力进行测定，获得一株具有高效嗥吟核苷降解能力的乳酸菌，其肌苷、鸟苷的降解率可达9&07%和96.1%。

经生化鉴定实验和16S rRNA序列扩增和比对，确定该菌为短乳杆菌(ctobacillus brevis)#耐受性实验表明：该菌具有良好的耐酸、耐胆盐以及耐受饱腹人工胃肠液的能力，且其在饱腹的人工肠液中嗥吟核苷降解能力不受影响。

因此，该菌株是可用于HUA防治微生态菌剂开发的潜在优良菌株。

关键词:高尿酸血症；降解嗥吟核苷；短乳杆菌
中图分类号:TQ464；Q939文献标志码:A文章编号1674-2214(2021)01-0044-06
Screening,identification and characterisations of a lactic acid bacterium with high ability of purine nucleoside decomposing
CHEN Shenliang1,ZHANG Yuekai1,LI Chenxin1,SHEN Shiying1,
WU Lincai1,ZHAO Weirui1,HU Sheng1,MEI Lehe1'2
(1.College of Biology and Chemical Engineering,Ningbo Tech University,Ningbo315100,China；2.Department of
ChemicalandBiologicalEngineering"Zhejiang University"Hangzhou310027"China)
Abstract:Adjunctive treatment and prevention of hyperuricemia(HUA)by lactic acid bacteria (LAB)withhighpurinenucleosidedegradingcapacityenablerelievingoravoidingtheimpactof dietaryrestrictionon HUA patients Inthisstudy"thedegradationcapacityofpurinenucleoside of56lactic acid bacteria isolated from kimchi was determined by high performance liquid chromatography(HPLC)analysis"which resulted alactobaci l us with highly e f ective purine nucleosidedegradationability Its degradation rates of inosine and guanosine were9807%and
96.1%,respectively.Based on biochemical testing and16S rDNA classification,the strain was
identified as Lactobacillus brevis.The bacterium showed excellent tolerance capacity in the
condition of acid"bile salt and artificial intestinal fluid with food suspension"and its nucleoside-decomposingability was not a f ected by the environment of artificial intestinal juice withfood suspension Therefore"thisstrainisapotentialmedicinalstrainthatcanbeusedfordeveloping microecologicalagenttopreventandtreatHUA
Keywords:hyperuricemia；purine nucleoside degrading；laclobacillus brevis
收稿日期2021-01-04
基金项目：国家自然科学基金资助项目(1971372,31670804)宁波市科技创新2025重大专项(2019B10060)；浙江省教育厅一般科研项目(Y201839915)；浙江省新苗人才计划立项项目(2020R401192)
作者简介：陈沈梁(1999—)，男，浙江温州人，研究方向为酶工程与生物催化,E-mail:chenshenliang@&通信作者：赵伟睿讲师, E-mail:zhaowrzju@&
第1期陈沈梁，等：高效降解瞟吟核苷乳酸菌的筛选、鉴定及特性研究-45-
高尿酸血症（Hyperuricemia,HUA）是因嘌吟代谢或排泄失常而导致血尿酸含量显著超过正常范围的慢性临床综合征⑴。

HUA不仅是痛风病症发生的生化基础，而且也与糖尿病、心脑血管疾病及尿酸盐肾病等慢性肾病的发生密切相关，严重威胁人类健康⑵。

流行病学研究表明：随着我国人民物质生活水平的提高以及生活方式的改变，我国HUA 发病率剧增，且呈年轻化趋势目前，HUA的防治主要采用药物控制和限制人体嘌吟物质的摄入量&HUA治疗药物虽然有效但副作用大，长期使用会造成严重的不良反应&对于饮食限制来说，由于高嘌吟食物众多，严格限制饮食很难做到营养素摄入平衡4&此外，由于鲜味物质也属于嘌吟类物质5,因此高尿酸血症患者也必须限制鸡精等鲜味剂的摄入，这些无疑会使患者的生活质量受到极大影响，患者往往难以坚持&因此，寻找和开发新型高效、副作用低或无副作用的HUA治疗与预防方法具有重要现实意义&
随着对乳酸菌益生作用的关注，日本科学家发现具有高效嘌吟核苷分解能力的乳酸菌可以在肠道有效吸收并降解食物中的嘌吟核苷，从而降低人体对食物中嘌吟核苷的吸收量，起到控制嘌吟核苷摄入、降低血尿酸含量的目的6&应用乳酸菌对HUA进行防治可以避免或减轻传统的严格饮食限制对患者生活质量的影响7&目前，日本明治株式会社囚、大冢制药株式会社8已相继筛选到多株具有高效嘌吟核苷降解能力的乳酸菌，并利用动物实验验证其有效性，其中明治株式会社Lactoba­cillus gasseri PA-3产品已进入商业化应用，而我国在该领域研究尚在起步阶段［9］&本研究以传统发酵食品泡菜为原料，对其中具有高效嘌吟核苷降解能力的乳酸菌进行筛选和鉴定，并对其抗生素敏感性、酸性耐受能力、胆盐耐受能力以及人工消化液耐受能力等生物学特性进行考察［10］，以期为研发我国自主知识产权的HUA辅助治疗生物菌剂奠定基础&
1材料与方法
1.1实验材料和主要试剂
宁波市售泡菜；MRS肉汤、药物药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司；乳酸菌微量生化鉴定条，青岛海博生物技术有限公司；溶菌酶、肌苷、鸟苷，生工生物工程（上海）股份有限公司；胃蛋白酶（USP级，1:3000）、胰蛋白酶（BR,1:250）、牛胆粉（40%胆酸），上海源叶生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；快速高保真DNA聚合酶，北京全式金生物技术有限公司&
1.2嘌呤核苷降解菌的筛选
筛选方法参考Tsuboi等⑺11的方法进行，略有改动&利用MRS固体平板分离得到泡菜中的单菌落，将获得的单菌落接种于MRS液体培养基中，于37C静置培养24h后，获得种子培养基&离心收集适量菌体，经0.9%NaCl彻底重悬清洗后，向其中加入750（L反应液（含有1.26mmol/L肌苷、1.26mmol/L鸟苷的0.1mol/L K3PO4溶液（pH 7.0））,于金属浴37C,800r/min反应1h。

反应结束后,00C处理5min终止反应&离心取上清,测定剩余肌苷、鸟苷降解率）10*。

肌苷、鸟苷降解率
计算公式为
降解率液工残液X100%。

原液
1.3肌苷、鸟苷的HPLC检测方法
采用高效液相色谱法（HPLC）12*测定肌苷和鸟苷的降解率。

色谱条件:反相色谱柱，Hypersil ODS2 C18（4.6mm X250mm）;流动相V（0.01mol/L KH2PO4）:V（色谱甲醇）=95:5；流速1mL/min,测定波长260nm,柱温30°C。

1.4菌株的鉴定
采用生化反应和16S rDNA序列比对两种方法进行菌种鉴定&糖发酵反应按乳酸菌微量生化鉴定条说明书进行&16S rRNA同源比对鉴定：提取乳酸菌的基因组，利用16S rRNA通用引物（16sF：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16sR：GGCTA CCTTGTTACGACTT）通过PCR反应扩增菌种的16S rDNA基因片段&PCR扩增程序为：95C, 5min；（95°C,1min；50°C,30s；72°C,60s）X32；72°C,5min；冷却至4°C保存&PCR产物经验证后送于生工生物工程（上海）股份有限公司测序&将测序结果于GenBank中进行BLAST比对分析）13*,并利用MEGA软件进行系统发育分析&
1.5抗生素敏感性试验
利用纸片琼脂扩散法［1415］,测定菌种对不同抗生素的敏感程度&将药物敏感纸片均匀分布在含有一定量种子培养基的MRS固体平板上，37C培养48h,测量抑菌圈直径&
1.6菌株对酸耐受性、胆盐耐受性的测定
1.6.1酸耐受性测定
将种子培养基置于pH分别为6.2（对照），2,
-46 -
发酵科技通讯第50卷
3"的MRS 液体培养基并混匀，37 C 下处理0,1, 2,4 h 后进行平板计数）1617&1.6.2 胆盐耐受性测定
以2%的接种量将种子培养基分别接种到牛胆 粉质量分数为0（对照）和0. 3%的MRS 液体培养
基中，37 C 下静置培养，分别在0,4,12,24 h 涂布, 测定活菌数）14*
&
1.7菌株人工消化液耐受性及饱腹人工消化液下
嘌呤降解情况
分别考察菌株在空腹、饱腹状态下的人工消化
液的耐受能力&人工胃液3.33%胃蛋白酶;人工肠 液（g/L ）：NaHCOs 12. 5,胰酶 0. 9,胆盐 3. 0,pH
6.8；营养液（g/L ）：阿拉伯半乳糖1,胶质2,木聚糖 1,土豆淀粉3,蛋白胨1,酵母粉3,黏蛋白4丄-半胱
氨酸0.5,葡萄糖0.4。

空腹状态：人工胃液（HC1调 整pH = 2）和人工肠液&饱腹状态：用营养液配制 的人工胃液（pH = 3）和人工肠液&耐受性的测定:
将种子培养基重悬于人工胃液中，37 °C,800 r/min 处理2 h,离心收集菌体，重悬于的人工肠液中,
37 °C,800 r/min 处理4h ；从重悬于人工胃液开始,
表1
筛选菌株嘌呤降解率记录表
每隔2 h 进行平板菌落计数&
测定菌株在模拟饱腹人工肠液环境下嘌吟降解
能力&离心收集适量菌体，用0. 9% NaCl 充分清
洗，将菌体分别重悬于750 （L 肌苷和鸟苷浓度都为
1. 26 mmol/L 的饱腹人工肠液，37 C ,800 r/min 反
应1 h 后测定嘌吟核苷降解率&
2
结果与分析
2.1高效降解嘌呤核苷乳酸菌的筛选
从宁波市售泡菜中分离得到56株乳酸菌，采
用高效液相色谱法测定其嘌吟核苷降解能力，结 果如表1所示，所有菌株虽然都有一定程度的嘌
吟核苷降解能力，但降解能力差异较大，其中4号 和5号菌株对肌苷、鸟苷的降解能力最高，超过了
95 %，与日本研究者Kaneko 等）18*
筛选获得的 HUA 辅助治疗菌株降解能力（核苷嘌吟降解效果
均接近100%）相似&此外，所有菌株自身对肌苷、
鸟苷的降解能力趋于一致，这与Kaneko 等）18*
的研 究结果也相一致&
Table 1 Record of purine degradation rate of selected strains
编号
降解率/%
编号
降解率/%肌苷
鸟苷
肌苷
鸟苷
177. 5978 24
2
56 9356 83597. 9995. 216 2. 34
5. 73959 09
58 721037. 9691. 50
13
27 6729. 18
1423. 4724. 641717. 34
18 4218
17. 37
16. 292126 9029. 322214 2617 22
2523 08
23. 9826
23. 4125. 672943. 6949. 35
3029. 1429. 7633
22 5124 33349 05
9. 52
3710. 69
10. 9738
22 0823 534130 4335. 354215. 7419. 194530 0728 72
46
14 5615. 324912. 16
13. 325014 9115. 37
53
38 6635. 80
54
44 70
48 13
编号
降解率/%
编号
降解率/%
肌苷
鸟苷
肌苷
鸟苷
3353135. 87498 07
96. 107768960. 42877 9078 42
111520
15. 301223 07
24 7615297830. 0916
15. 8816. 87
19
137314 54
2019. 34
20 23
23
1681
17. 952422 3823. 4127769 6. 99
28
9. 049. 46
31128513. 813223 07
24 0935148416. 7736
13. 76
15. 92
39
1804
18 7540 6. 776 8043111111 62
4412 3213. 8147842484 14
48
16. 99
17. 88
51145715. 325222 0525 2055
2363
24 68
56
39 58
42 10
2.2菌株的鉴定对4号和5号菌株进行菌种鉴定，菌株糖利用
结果如表2所示，与《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八 版）进行比对，发现4,号菌株的糖利用特性完全一
致，且与短乳杆菌（.LaclobaciUus brevis ）基本符合& 采用PCR 技术扩增4号和5号菌株的16S rRNA ,
并进行序列测定，测序结果如图1所示&将测序结 果在NCBI 中进行BLAST 分析,发现两菌株的16S
rRNA 序列比对完全一致,且都与Lactobacillus breis b4的同源性为99%。

结合糖利用结果，确
定4号菌和5号菌为同一来源菌株，选取4号菌株
进行后续研究&从NCBI 数据库收集不同种属菌 株的16S rRNA 序列，用MEGA 软件，进行进化遗
传、系统发育分析（图2）,可知4号菌株与L. breis 位于同一个簇群&因此，确定4号菌株属于短乳 杆菌&
第1期陈沈梁，等：高效降解嘌吟核苷乳酸菌的筛选、鉴定及特性研究・47・
表2菌株糖类利用特性表
Table2Carbohydrateutilizationcharacteristicsofstrains
编号七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖菊糖乳糖1%马尿酸钠4+①—②+
5+—+
L.brevis d③一+（1）®/—d1⑤/⑥1/
①表示反应结果为阳性；②表示反应结果为阴性；③表示有些菌株为+，其他的为一；④表示延迟反应；⑤表示弱、慢或阴性；2表示伯杰氏手册中无对应糖利用实验&
GGGGGGGGCTGCCTATACTGGCAAGTCGAACGAGCTTCCGTTGAATGACGTGCTTGCACTGATTTCAACAATGAAGCGAGTG
GCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAATCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAA
CAAAATCCGCATGGATTTTGTTTGAAAGGTGGCTTCGGCTATCACTTCTGGATGATCCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTGA
GGTAAAGGCCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACT
CCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTC
GGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACACCTTTGAGAGTAACTGTTCAAGGGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCAC
GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGC
GGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGA
CAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAAC
TGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTG
TTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCA
AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAC
ATCTTCTGCCAATCTTAGAGATAAGACGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG
TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTG
CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG
ACGGTACAACGAGTTGCGAAGTCGTGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGC
CTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT
CACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGAGATAACCTTCGGGAGTCAGCCGTCTAAGGGGGCCAGGGT
图1strain4的16S rDNA测序结果
Fig.116S rDNA sequencing results of stain4
100Lactobaclillus DSM21775NBRC103853strain L13
88Lactobaclillus se”加aZz”血Z DSM21775NBRC103853
y Lactobaclillus hammesii train type strain:TMW1.1236
Lactobaclillus cerevisiae strain TUM BP140423000-2250
67
Lactobaclillus brevis strain ATCC14869
strain4
Lactobaclillusparabrevis strain LMG11984
Lactobaclillus koreensis JCM16448strain DCY50
100100
—Lactobaclillusyonginensis strain THK-V8
Lactobaclilluspaucivorans strain TMW1.1424 93
Lactobaclillus spicheri strain LTH5753
-----Lactobaclillus namurensis strain R-27965
981j
-Lactobaclillus zymae strain R-18615
Lactobaclillus acidifarinae strain R-19065
Lactobaclillus oryzae JCM18671strain SG293
Lactobaclillus curvatus strain DSM20019
Weissella hellenica strain15070.010
100L Weissella hellenica strainNBRC15553
图2菌体16S rDNA序列的系统发育树
Fig.2Phylogenetictreeba#edonthe16SrDNA#equenceofi#olateand#equence#ofrelating#pecie#
2.3菌株的抗生素敏感性
鉴定乳酸菌的药敏谱，是乳酸菌安全性评估与使用的必要部分「19*。

从表3可知：4号菌株对哌拉西林、大环内酯类抗生素如红霉素和头抱哌酮抗生素的敏感程度较高，尤其对哌拉西林最为敏感；而在含有苯卩坐西林纸片的培养基上无抑菌圈，在含有青霉素的培养基上抑菌圈的直径较小，可知菌株对苯坐西林、青霉素的敏感程度较低或不敏感。

・48・发酵科技通讯第50卷
表34号菌株抗生素敏感性结果表
Table3Results of antibiotic sensitivity of strain4单位：mm
抗生素种类抗生素
名称
每片抗生素
质量/(g
试纸1试纸2
直径1
试纸3
直径2平均值
•总平均值直径1直径2平均值直径1直径2平均值
大环内
酯类
红霉素1521.6822.0321.8621.0721.1821.1319.5219.2019.3620.78士1.05庆大霉素1015.00140014.5017.5214.8816.2014.3816.0615.2215.31士0.70氨基糖卡那霉素3010.128.549.33111810801099116810.4811081047士080苷类新霉素3020.501940199519.6021002030180417.7617901938士106丁胺卡那3013.4613.1013.281188112811.5814.8814.2014.5413.13士1.20头抱曲松3021.062000205320.6217.781990180419.3618.701948士076头抱氨苄3013.201344133210.74110010.87100810.1810131144士136头抱他啶301128113011291178118011.791200119912001169士030头抱类头抱拉定3017.42180417.7320.681960201418.6417.42180318.63士107头抱哌酮7520.1019.3819.7422.0022.2822.1420.1620.4020.2820.72士103头抱唑林3016.141430152215.1615621539147014.1614431501士042头抱咲辛3014.3414.8214.5812.9413.6413.2916.0816.04160614.64士113
四环素类
四环素3012.6012.5812.5912.5012.4912.5012.1612.2012.1812.42士0.18多西环素3016.5818.6817.6314.20112712.74119210.26110913.82士2.78米诺环素3017.0016.80169016.9217.2017.0620.5419.2819.9117.96士138青霉素68.168.027.898.367.597.987.968.058.24802士015
青霉素类哌拉西林10024.0624.22241423.5624.262391249225.7225322446士061羧苄西林10018.8418.6618.7519.32190219.17191419.2019.171903士020氨苄西林1012.9212.08125010.90115211.2111309.2110.261132士092苯唑西林1无抑菌圈
2.4菌体的酸、胆盐耐受性人体正常胆汁的质量分数为0.3%&4号菌株
良好的酸耐受性、胆盐耐受性是乳酸菌能够在在胆盐质量分数为0.3%的MRS培养基(7C条件
人体内发挥生理功能的前提，因此有必要对筛选菌株的酸耐受性、胆盐耐受性进行考察&4号菌株在不同的酸性条件下的存活状况如图3所示，pH=2的酸性环境对该菌的存活率影响较大，但在pH为3,4的条件下，该菌的存活数在4h内始终保持108cfu/mL以上&人体胃酸pH值在空腹或食用酸性食物时,一般为1.5〜2,而食用碱性食物时，pH 可达4〜5,—般通常情况下pH=3「20「21*。

以上结果，说明4号菌株具备了耐受人体通常情况下胃酸环境的能力&
10
0----------------
01234
时间/h
图34号菌株耐酸性实验结果
Fig.3Acidtolerancere#ultof#train4下处理4,12,24h后，活菌数仍可达到108cfu/mL及以上且保持相对稳定，实验结果如图4所示，说明该菌具备耐受人体正常胆汁浓度的能力&
图44号菌株耐胆盐实验结果
Fig.4Bile#alttolerancere#ultof#train4
2.6菌株人工消化液耐受性及饱腹人工消化液下
瞟呤降解情况
乳酸菌能顺利到达肠道并在肠道中存活是其发挥益生功能的关键,通过模拟人体的消化道环境，可以反映菌种在经过人体胃肠道消化后的存活状况，实验结果如图5所示&结果表明：在空腹状态下，4号菌株经过胃后，由于受到较低pH的胁迫，活菌数下降明显;而在饱腹状态下，经人工胃液和人工肠液的消化后，活菌数基本不受影响，表明该菌种经人体饱
第1期陈沈梁，等：高效降解嘌吟核苷乳酸菌的筛选、鉴定及特性研究・49・
腹状态胃肠道消化后，依然能保持较好的存活能力。

因此"号菌可在饭后服用，以便其能更好地发挥生理功能&实验证明:该菌种在饱腹人工肠液条件下嘌吟核苷基本降解完全，降解率均达96%以上,具备在人体肠道饱腹状态下降解食物中嘌吟核苷的能力&
7
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时间/h
图54号菌株人工消化液耐受实验结果
Fig.5Artificial digestive juice tolerance results of strain4 3结论
应用具有高效嘌吟核苷降解能力的乳酸菌对高尿酸血症（HUA）进行辅助治疗和预防，可以在一定程度上或完全解除HUA患者在饮食上的严格限制，提高其生活质量&本研究从泡菜样品中筛选得到的一株具有高效降解嘌吟核苷能力的菌株，经糖酵解实验和16S rRNA序列比对，确定4号菌株为短乳杆菌，该菌株对嘌吟核苷降解能力与日本科学家报道的最高活性菌株的降解能力基本一致；该菌对哌拉西林、红霉素和头抱哌酮等抗生素有高敏感性，且具有良好的耐酸、耐胆盐和耐受饱腹人工胃肠液的能力，而且在饱腹的人工肠液中其嘌吟核苷降解能力不受影响&因此，该菌是开发用于辅助治疗和预防HUA微生态菌剂的备选优良菌株&
致谢：在此特别鸣谢徐晨航、邹培波参与实验。

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(责任编辑：刘岩%。