香蕉一个钾离子通道基因的克隆与生物信息学分析

香蕉一个钾离子通道基因的克隆与生物信息学分析
作者：杨日才姜成东
来源：《热带农业工程》2017年第01期
摘要从香蕉中克隆了一个钾离子通道基因MaAKT2的cDNA的ORE序列并初步分析其功能。

采用PCR技术克隆该基因，利用生物信息学方法分析基因及推导蛋白的序列，利用
RT-PCR技术对该基因的组织器官表达特性进行分析。

结果表明，MaAKT2的cDNA ORE序列长为2 463 bp，编码821个氨基酸；MaAKT2蛋白属于植物弱内整流钾离子通道蛋白，该蛋白具6个跨膜区域，拥有CNBD、ANKY及KHA特征结构域；MaAKT2在系统发生上更接近单子叶植物弱内整流钾离子通道蛋白；MaAKT2可在香蕉根、茎、叶、花以及果实中表达，在叶中的表达量高于其它器官。

MaAKT2基因的克隆为在分子水平研究香蕉钾离子吸收利用机制奠定基础。

关键词香蕉；钾离子通道；基因克隆；生物信息学；表达分析
中图分类号 S188
Cloning and Expression Analysis of MaAKT2-like Gene from Banana
YANG Ricai JIANG Chengdong
（College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228）
Abstract The objective of this study is to clone the ORF of cDNA from a gene MaAKT2 from banana and primarily analyze its function. cDNA sequence was obtained by the approach of PCR amplification， the putative amino acid sequence were analyzed by bioinformatics software and the expression patterns in different organs was analyzed by RT- PCR. Sequence analysis indicated that the ORF of MaAKT2 gene is 2463bp in length and encodes an 861 amino acids protein. MaAKT2 protein belongs to weak inward rectifying potassium channel protein characterized with six transmembrane regions， a CNBD domain， a ANKY domain and a KHA domain. The phylogenetic analysis showed that MaAKT2 had a closer relationship with Anthurium amnicola， Ananas comosus，Oryza sativa， and Zea mays； MaAKT2 is expressed in all organs such as roots， corns， leaves，flowers and fruits with higher level in leaves than other organs. The clone of ORF of MaAKT2 is a basement for the study of the mechanical of banana potassium absorption and transport in molecular level.
Key words banana ； potassium channel ； gene clone ； bioinformatics ； expression analysis
香蕉是一种高钾作物，其正常生长发育需要消耗大量的钾肥，生产上适时提高钾肥的施用量可有效缩短香蕉的生产周期、提高产量和品质[1-2]。

香蕉生产上每年要施用大量的钾肥，而我国南方香蕉栽培产区土壤普遍缺钾，加之我国钾资源缺乏，因而提高香蕉钾肥利用效率对于保证香蕉产业可持续发展具有重要意义[3-4]。

探究香蕉钾吸收利用机制对于提高香蕉钾肥利用效率至为重要。

而研究钾吸收利用的分子调控机制，对于改良香蕉种质具有重要意义。

植物钾离子的吸收和转运主要通过钾离子通道和转运体进行，克隆香蕉钾离子通道和转运体基因是研究其钾吸收利用的分子机制的基础[5]。

AKT2基因是主要在植物根、茎、叶及花等器官的韧皮部中表达的基因，其编码的AKT2钾离子通道蛋白属于弱内整流钾离子通道，其功能主要和钾离子在植株体内长距离的转运有关[6-8]。

目前已在植物中克隆出多个弱内整流钾离子通道基因，如拟南芥的AtAKT2[6]、玉米的ZMK2[9]、雨树的SPICK1和SPICK2[10]等。

但作为高钾作物的香蕉中尚未见到相关研究。

克隆香蕉AKT2基因对于研究香蕉的高钾需求特性及其钾离子长距离运输机制具有重要意义。

钾离子通道基因编码序列较长，克隆这类基因具有一定的难度，需要采用适宜的克隆策略。

最初克隆钾离子通道和转运体基因多采用异源表达技术获得[11-12]。

随着一些作物基因组测序的完成及生物信息学技术的发展，同源克隆和电子克隆[13-14]也成为钾离子通道基因克隆的重要途径。

目前香蕉的基因组测序工作已完成，使得采用同源策略克隆香蕉钾离子通道基因成为可能。

本研究根据二倍体香蕉基因组序列设计引物利用PCR技术以中国主栽三倍体香蕉品种巴西蕉为材料克隆了AKT2钾离子通道基因，并对其进行了生物信息学分析及器官表达特性分析，为进一步分析香蕉钾离子吸收利用机制奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
基因克隆所用材料为巴西蕉健壮成熟叶片。

克隆载体为TaKaRa公司的pMD-18T，大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司。

组织器官特异性分析所用材料为香蕉主栽品种巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazil）。

选取雌花花后发育约100-110 d，处于绿熟阶段，棱角明显的果实即7成熟状态果实植株的白色肉质根、球茎、叶片、雌花以及果实进行器官特异性分析。

各器官用无菌水清洗后立即用液氮速冻。

1.2 方法
1.2.1 RNA的提取及cDNA合成
香蕉果实和花RNA的提取采用改良的CTAB法[15]。

香蕉营养器官球茎、叶片和根系的RNA的提取方法采用改良SDS法[16]。

RNA的反转录采用Fermentas的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒合成。

具体步骤参考试剂盒说明书。

1.2.2 MaAKT2基因cDNA ORF序列的克隆
根据香蕉基因组测序序列设计5′端和3′端引物，5′端引物：5′-CGAGCTCATGGAGAGCGGCCATGAGA-3′；3′端引物，5′-ACATGCATGCTTGGCATTTGCTATGAAGCTTAACA-3′。

PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35个循环。

PCR扩增产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳分析，回收纯化后连接到载体上送生化公司测序。

1.2.3 MaAKT2蛋白序列的生物信息学分析
通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站中的BlastX对序列进行比对，选取同源性>30 %的序列进行系统进化分析。

利用Protparam在线分析软件进行蛋白理化性质分析，利用TMpred和TMHMM在线分析软件对MaAKT2蛋白进行跨膜区预测。

采用NetPhos 3.1 Server分析MaAKT2磷酸化位点。

利用SWISSMODEL（http：///）同源建模预测蛋白的三维空间模型。

利用DNAMAN对不同物种的AKT2蛋白序列进行比较。

利用Clustal1.81和Mega3.0软件构建MaAKT2蛋白与其它植物AKT2蛋白的系统进化树。

1.2.4 器官表达特性分析
利用RT-PCR技术分析MaAKT2的组织器官表达特性。

在所获全长序列上选取一段特异序列设计引物，上游引物：5′-AGGAACACGACGCACAATGG-3′；下游引物：5′-GCCTTACATTCCGCACCAG-3′。

内参基因为香蕉Actin，上游引物为：5′-TGTAGCAATTCAGGCTGTTCTT-3′；下游引物为：5′-TCAGAGATGGCTGGAAGAGAAC-3′。

PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环。

2 结果与分析
2.1 MaAKT2基因cDNA序列的克隆及生物信息学分析
基于香蕉基因组测序序列，通过PCR扩增，得到一段大于2 000 bp产物（图1A），将产物克隆到载体上鉴定后送生化公司测序（图1B），经与参照基因及blast比对，确认该片段为目的基因的ORF，命名为MaAKT2。

该基因cDNA ORF全长2 463 bp，编码821个氨基酸残基的蛋白质（图2）。

利用ProtParam分析MaAKT2蛋白的理化性质，结果表明，MaAKT2的分子式为
C4144H6581N1131O1208S47，相对分子量为93 082.51，等电点为6.53，理论推导半衰期为30 h。

不稳定系数为32.02，属于稳定蛋白。

该蛋白中相对含量比较多的氨基酸是Leu（98个，
11.9 %）、Glu（56个，6.8 %）、Val（55个，6.7 %）、Ala（52个，6.3 %）、Arg（51个，6.1 %）。

Pyl和Sec含量为0。

总的带负电荷的残基（Asp+Glu）为96，总的带正电荷的残基（Arg+Lys）为92，脂肪指数为96.54，亲水性平均系数为-0.098，预测该蛋白为水不溶性蛋白，属于电压门控内内整流钾离子通道家族跨膜蛋白。

TargetP1.1 Server预测显示MaAKT2定位于叶绿体、线粒体及次生代谢途径的可能性较小，定位于其它部位的可能性较大
（0.839）。

MaAKT2与其同源序列氨基酸相似性达到99 %，其氨基酸仅存在7处不同，但其对应氨基酸残基的极性则完全相同（图3A）。

MaAKT2蛋白的理化性质与二倍体香蕉中的同源基因预测的AKT2基本相同。

TMpred分析显示MaAKT2具有7个跨膜结构域，分别位于62-83、95-115、127-146、152-172、193-218、243-265和274-292氨基酸残基处，其中243-265氨基酸残基处为跨膜的P 结构区域，含有GYGD保守序列（图2）。

MaAKT2蛋白氨基酸序列的保守结构域分析结果（图4A）显示，该基因具有植物弱内整流钾离子通道家族典型的环核苷酸结合域CNBD （303-495 aa）、锚定蛋白结构域Anky （523-687 aa）和KHA区（738-821 aa）家族特征结构域（图2，图4A）。

MaAKT2具有两处配体结合位点分别位于444G、445E和454Q、455S、456L。

磷酸化位点分析表明该序列具有25处磷酸化位点（图3B）。

利用SWISS-MODEL预测MaAKT2蛋白的三级结构，结果同样表明该蛋白具有多个α-螺旋结构（图4B）。

比较MaAKT2与其它物种AKT2氨基酸序列，发现植物AKT2蛋白氨基酸序列具有较高的同源性（图5）。

根据香蕉MaAKT2和其它物种已发表的及部分推导的AKT2的氨基酸序列构建系统发生树的结果见图5。

全部序列可被分为2个大簇（clades），三倍体香蕉巴西蕉的AKT2和同为单子叶植物的菠萝、红掌、水稻、玉米及大麦等植物的AKT2构成一簇，而其它双子叶植物构成一簇。

香蕉的AKT2和同为单子叶植物的AKT2关系较近，与可可、拟南芥等植物的AKT2亲缘关系较远（图6）。

2.2 MaAKT2基因组织器官表达特性
MaAKT2的器官表达特性分析结果见图7。

MaAKT2基因在香蕉根、球茎、叶、花和果实等器官中均表达，在根中的表达量较低，在球茎、花、果中表达量较高，在叶中表达量最高。

3 讨论
弱内整流钾离子通道基因是重要的钾离子通道类型，目前已在植物中克隆出多个弱内整流钾离子通道基因，如拟南芥的AtAKT2[6]、玉米的ZMK2[9]、雨树的SPICK1和SPICK2[10]等，且在菠萝、水稻等多个完成基因组测序的植物中发现该类基因[17]。

该类基因推导的蛋白序列较长，拟南芥的AtAKT2为802个氨基酸残基[6]，雨树的SPICK2为832个氨基酸残基[10]，玉米的ZMK2为846个氨基酸残基[9]，利用PCR技术克隆该类基因的ORF存在一定难度。

在对MaAKT2基因cDNA的ORF序列进行PCR扩增时，本研究将扩增时每个循环中的延伸时间设定为3 min，成功地克隆出该基因的ORF序列。

这对今后克隆其它钾离子通道基因是个有益的借鉴。

本研究从三倍体香蕉中克隆到的弱内整流钾离子通道基因MaAKT2与二倍体香蕉中的同源基因的ORF核苷酸序列存在着高度相似，相似性达99 %，其对应蛋白质氨基酸序列也仅存7处差异（图3A），但这些氨基酸残基的极性（亲疏水性）却完全一致，这表明两个基因的功能可能没有发生改变。

对MaAKT2基因ORF序列推导的MaAKT2蛋白分析发现，该序列具有弱内整流钾离子通道基因典型的序列特征，即具有典型的N端的6个跨膜序列，P-loop，环核苷酸结合域CNBD，锚定蛋白结构域Anky和KHA家族特征结构域[18-19]。

这表明AtAKT2的结构或功能与其它植物的弱内整流钾离子通道基因可能基本相同。

系统发生分析表明，MaAKT2和同为单子叶植物的菠萝、红掌、水稻、玉米及大麦等植物的弱内整流钾离子通道蛋白亲缘关系较近，而与可可、拟南芥等双子叶植物的弱内整流钾离子通道亲缘关系较远。

表明其功能可能更接近于单子叶植物。

不同物种AKT2类钾离子通道同源性较高，尤其是在构成离子通道的跨膜区域、P-loop及CNBD结构域相似性最高，这可能与钾元素均以钾离子的形式在不同物种中被吸收利用有关。

但不同物种的AKT2类钾离子通道的锚蛋白结构域和KHA结构域则存在较大差异。

锚蛋白结构域的功能与钾离子通道蛋白定位于细胞骨架或与其它调节蛋白的相互作用有关[20]。

而KHA 结构域则是钾离子通道蛋白形成钾离子通道所必需，KHA结构域介导了通道蛋白的异聚化并使其稳定[21-23]。

此外，不同物种AKT2类钾离子通道的磷酸化位点也存在差异。

钾离子通道蛋白需要被磷酸化才能被激活，进而定位到质膜上介导胞外钾离子向细胞内流动[24-25]。

拟南芥的AtAKT2上仅有15处磷酸化位点[6]，而MaAKT2序列却有高达25处的磷酸化位点；此外AtAKT2由CBL4/CIPK6所介导的膜定位机制也与AKT1不同。

这表明MaAKT2被激活所涉及的具体信号通路可能与拟南芥等植物不同[6]。

香蕉是一种高钾植物，其正常生长发育需要大量的钾离子，而且其根系钾离子吸收效率也远高于其它植物[26-29]。

香蕉AKT2与其它物种AKT2类钾离子通道序列的差异是否和这一特性有关，尚需深入研究。

基因的功能与其表达特性密切相关。

拟南芥的弱内整流钾离子通道基因AKT2主要在拟南芥韧皮部中表达，它主要介导钾离子在韧皮部中的装载或卸载，使得钾离子可以在植株体内进行长距离的转运[6-8]。

玉米的弱内整流钾离子通道基因ZMK2也在胚芽鞘的维管系统中表达[9]。

这些表达特性表明植物弱内整流钾离子通道基因的功能均与钾离子在植株体内长距离的转运有关。

本研究中在香蕉的根、球茎、叶片、花及果实中均检测到MaAKT2的表达，而香蕉的根、球茎、叶片、花及果实中均存在维管系统，这表明MaAKT2的功能可能也与香蕉植株内钾离子的长距离转运有关。

此外，拟南芥AKT2也可在叶片的表皮细胞和叶肉细胞以及保卫细胞中表达[6]，雨树的SPICK1和SPICK2表达特性与雨树叶片的节律性叶片运动有关[10]，这说明AKT2类离子通道的功能还与植物多种生理机制有关，MaAKT2可能还参与多种生理现象，相关研究尚需深入进行。

本研究克隆了香蕉MaAKT2基因的ORF，并对其进行了生物信息学分析，有关该基因的其它特性尚需深入进行。

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