毛细管电泳-电化学发光法测定荷叶中荷叶碱与莲子心中莲心碱含量

毛细管电泳-电化学发光法测定荷叶中荷叶碱与
莲子心中莲心碱含量
罗珍连，邓光辉*
（广西民族大学化学化工学院，广西林产化学与工程重点实验室，广西高校化学与生物转化过程新技术重点实验室，
广西多糖材料与改性重点实验室培育基地，广西南宁 530006）
摘 要：建立毛细管电泳-电化学发光法同时测定荷叶中荷叶碱与莲子心中莲心碱含量的方法。

对三联吡啶钌（Ru(bpy)32＋）溶液浓度、检测电位、磷酸盐缓冲液浓度和pH值、进样时间和分离电压等实验条件进行考察和优化。

结果表明，在检测电位为1.20 V，运行缓冲液为10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 5.74），5 mmol/L Ru(bpy)32＋溶液，检测池内磷酸盐缓冲液浓度为60 mmol/L（pH 8.30），进样电压为8 kV，进样时间为10 s，分离电压为13 kV，荷叶碱检出限为7.7×10－7 mol/L（R SN=3），莲心碱检出限为7.8×10－7 mol/L（R SN=3）。

对浓度为
6.8×10－5 mol/L荷叶碱和3.1×10－5 mol/L莲心碱的标准品溶液进行5 次平行测定表明：荷叶碱峰面积的相对标准偏
差（relative standard deviation，RSD）为3.76%，迁移时间RSD为0.83%；莲心碱峰面积RSD为4.28%，迁移时间RSD 为1.37%。

该方法可用于测定荷叶中的荷叶碱与莲子心中莲心碱含量。

关键词：毛细管电泳；电化学发光；荷叶碱；莲心碱
Determination of Nuciferine in Nelumbinis Folium and Liensinine in Nelumbinis Plumula Using Capillary
Electrophoresis Coupled with Electrochemilumolinescence Method
LUO Zhenlian, DENG Guanghui*
(Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Key Laboratory of Chemical and Biological Transformation Process of Guangxi Higher Education Institutes, Guangxi Key Laboratory Cultivation Base for Polysaccharide Materials and their Modification, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China) Abstract: A new method was developed for the determination of nuciferine in Nelumbinis Folium and liensinine in Nelumbinis Plumula by capillary electrophoresis coupled with electrochemilumolinescence (ECL) detection. The optimized experimental conditions were determined as follows: Ru(bpy)32+ concentration, 5 mmol/L; detection potential, 1.20 V;
10 mmol/L phosphate buffer (pH 5.74) as running buffer, 60 mmol/L (pH 8.30) phosphate buffer contained in the detection
reservoir; injection time, 10 s; separation voltage, 13 kV. Detection limits (LOD) of 7.7 × 10-7 mol/L (R SN = 3) for nuciferine and 7.8 × 10-7 mol/L (R SN = 3) for liensinine were obtained. Relative standard derivations of electrophoretic peak area and migration time were 3.76% and 0.83% for 6.8 × 10-5 mol/L nuciferine and 4.28% and 1.37% for 3.1 × 10-5 mol/L liensinine from five replicate determinations, respectively. The method can be applied to detect nuciferine in lotus leaves and liensinine in Nelumbinis Plumula with satisfactory results.
Key words: capillary electrophoresis; electrochemiluminescence; nuciferine; liensinine
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706031
中图分类号：O657.8 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）06-0197-05引文格式：
罗珍连, 邓光辉. 毛细管电泳-电化学发光法测定荷叶中荷叶碱与莲子心中莲心碱含量[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 197-201. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706031.
LUO Zhenlian, DENG Guanghui. Determination of nuciferine in Nelumbinis Folium and liensinine in Nelumbinis Plumula using capillary electrophoresis coupled with electrochemilumolinescence method[J]. Food Science, 2017, 38(6): 197-201.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706031.
收稿日期：2016-07-07
基金项目：广西壮族自治区自然科学基金项目（0640038）；国家自然科学基金地区科学基金项目（21365004；21065001）；
广西高校科学技术研究重点项目（2D2014041）；广西高校人才小高地建设创新团队项目（桂教[2011]47）
作者简介：罗珍连（1989—），女，硕士研究生，研究方向为药物分析。

E-mail：1184027229@
*通信作者：邓光辉（1957—），男，教授，硕士，研究方向为药物分析。

E-mail：dgh321@
荷叶是睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaerth.）的叶，在2002年3月中国卫生部卫监第51号文将荷叶列为既是食品又是药品。

荷叶在食用及药用等方面均有较广泛的应用[1]，荷叶具有清热利湿，升发清阳，降脂减肥，止血散瘀等作用[2]。

近年来，市场上已开发出各种以荷叶为主要成分的降脂减肥食疗制品，如减肥茶和降脂胶囊等[3]。

荷叶的化学成分复杂，其中以生物碱类化合物和黄酮的生物活性较高[4-5]，荷叶碱是其主要活性成分，因此选定荷叶碱为荷叶产品质量控制的指标性成分。

莲子心是睡莲科莲属植物成熟种子中的绿色胚芽，具有清心安神，交通心肾等功效[6]，近年来以莲心为原辅料可开发适用于特定人群食用、具有调节机体功能的保健食品，如辅助降血压、辅助降血脂、清咽、辅助降血糖、抗氧化、增强免疫力的保健食品[7]。

莲子心的化学成分有生物碱、叶绿素、黄酮、有机酸、甾醇、挥发油及微量元素等[8]。

莲心碱是一种双苄基异喹啉单醚键型，属酚性生物碱，是莲子心中的主要活性成分之一[9]，因此选定莲心碱为莲子心产品质量控制的指标性成分。

荷叶碱含量测定的方法主有薄层扫描法[10]、高效液相色谱法[11-14]、反相高效液相色谱法[15]、非水毛细管电泳-质谱检测法[16]、高效液相色谱-二极管阵列-电喷雾质谱法[17]等，莲心碱含量测定的方法主有双波长薄层扫描法[18]、紫外分光光度法[19]、高效液相色谱法[20]、高效液相色谱-二极管阵列检测器[21]等，为了有效控制荷叶和莲子心产品的质量，需要建立一种操作简单、快速、高灵敏度的检测方法。

毛细管电泳-电化学发光（capillary electrophoresis-electrochemiluminescence，CE-ECL）法与上述方法相比具有进样量少、选择性高、灵敏度高、操作简单等优点[22-29]。

本实验采用CE-ECL法测定荷叶碱和莲心碱含量，为荷叶和莲子心产品质量控制提供定量分析方法。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荷叶南宁朝阳大药房；莲子心产自湖南，药材经广西民族大学姜明国教授鉴定。

三联吡啶钌（分析纯）美国Alfa公司；荷叶碱、莲心碱标准品（纯度99%）上海融禾医药科技发展有限公司；甲醇（分析纯）成都市科龙化工试剂厂；乙醇（分析纯）天津市北联精细化学品开发有限公司；磷酸盐缓冲液国药集团化学试剂有限公司；水为实验室自制的二次蒸馏水；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备
MPI-A型CE-ECL检测系统、直径500 μm Pt工作电极、Ag/AgCl参比电极、Pt辅助电极西安瑞迈分析仪器有限责任公司；分离毛细管（未涂层石英毛细管（50 μm i.d.，55 cm））河北永年锐沣色谱器件有限公司；PHS-3E型酸度计上海仪电科学仪器股份有限公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；1810-B型自动双蒸馏器金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制和样品处理
精密称取莲心碱对照品3.4 mg置5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至5 mL刻度，摇匀，配制成680 μg/mL 溶液作为对照品备用。

精密称取荷叶碱对照品2.5 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至5 mL刻度，摇匀，制成500 μg/mL溶液作为对照品备用，使用时再进行稀释。

将荷叶、莲子心药材碾成细粉，精密称取荷叶0.5 g，用90%乙醇溶液在固液比为1∶20（g/mL）条件下超声提取30 min，冷却，用含90%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤液用0.45 μm醋酸纤维膜过滤备用。

精密称取莲子心0.25 g，精密加入80%乙醇溶液25 mL，称定质量，超声提取30 min，放至室温，再称定质量，用80%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液用0.45 μm醋酸纤维膜过滤备用。

1.3.2 荷叶碱、莲心碱含量的检测
采用循环伏安法和恒电位法测定。

实验前，依次用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸馏水，运行缓冲液将石英毛细管冲洗各10 min，将工作电极依次用0.3、0.05 μm Al2O3粉末抛光，用水冲洗，再用二次蒸馏水超声清洗干净，吹干，将电极与毛细管安装在检测池上，用光学显微镜调节毛细管与工作电极之间的距离为（100±5）μm。

发光检测池中加入60 m m o l/L磷酸盐缓冲液（pH 8.30）与20 mmol/L Ru(bpy)32＋溶液配制而成的5 mmol/L Ru(bpy)32＋溶液，实验每2 h更新一次检测池溶液，以保证实验的稳定性。

测定时，将毛细管进样端插入10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 5.74）中，待发光信号基线稳定之后，采用电动进样方式在8 kV电压条件下进样10 s，然后施加13 kV的电泳电压，光电倍增管高压为800 V，电位为1.20 V进行分离检测，实验中所用溶液需用0.45 μm乙酸纤维素膜过滤。

2 结果与分析
2.1 Ru(bpy)32＋和荷叶碱与莲心碱的循环伏安和ECL行为分析
对含有5.0 mmol/L Ru(bpy)32＋的60 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 8.30），以及分别添加6.8×10－5 mol/L 荷叶碱和7.8×10－6 mol/L莲心碱标准液的缓冲溶液
（pH 8.30）进行循环伏安扫描和正向线性电位扫描，从图1A 可以看出，当都加入2 种碱后，曲线1、2相比于
Ru(bpy)32＋
溶液的电极电流曲线都得到明显的增强现象，
图1B 中曲线1、2也有明显的增强作用。

基于荷叶碱与莲
心碱对Ru(bpy)32＋
发光强度的增强作用，可建立测定荷叶碱与莲心碱的CE-ECL 方法。

A
2.52.01.51.00.50.0ˉ0.5ˉ1.0
0.20.40.6
0.8 1.0 1.2
1.4
⭥⍱/µA
⭥ս/V
123
4 0003 0002 0001 000
00.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4⭥ս/V
1
23
B
1.荷叶碱；
2.莲心碱；
3. 5 mmol /L Ru(bpy)32＋
60 m m o l /L 磷酸盐缓冲液（p H 8.30）。

图 1 循环伏安图（A ）和ECL 曲线图（B ）Fig. 1
Cyclic voltammograms (A) and electrogenerated
chemiluminescence curves (B)
2.2 检测电位的影响
Ự⍻⭥ս/V
图 2
检测电位的影响
Fig. 2 Effect of detection potential on ECL intensity of the analytes
检测池中缓冲液浓度为60 mmol /L 、pH 8.30、
5 mmol /L Ru(bpy)32＋
溶液，分离电压13 kV ，10 mmol /L 磷酸盐缓冲液为运行缓冲液，进样电压为8 kV ，进样时间为10 s ，实验考察1.00～1.25 V 范围内变化对发光强度的影响，如图2所示。

当检测电位低于1.00 V 时，荷
叶碱和莲心碱的发光强度都较弱，这是由于Ru(bpy)3
2＋
/ Ru(bpy)33＋
电对的半波电位（E 1/2）大约在1.0 V [30]，没有达到Ru(bpy)32＋的氧化电位，Ru(bpy)32＋不能有效在电极上
被氧化成Ru(bpy)33＋，产生Ru(bpy)33＋
效率低而使ECL 强度
低。

随着检测电位的升高，体系中产生的Ru(bpy)33＋
逐渐
增加，发光强度开始随着电位的增加而增大，当检测电
位为1.20 V 时，荷叶碱和莲心碱的发光强度达到最大值。

当检测电位大于1.20 V 时，荷叶碱和莲心碱的发光强度反而降低。

因此，选择1.20 V 作为荷叶碱与莲心碱的最佳检测电位。

2.3 缓冲液pH 值的影响
㕃 ⏢pH
图 3 缓冲液pH 值对发光强度的影响
Fig. 3
Effect of buffer pH value on ECL intensity
磷酸盐缓冲溶液pH 值影响分析物质的带电情况和毛细管的电渗流以及分离效率，从而影响分析物的发光强度。

在检测电位为1.20 V ，分离电压为13 kV ，采用电动进样方式，进样时间为10 s ，进样电压为8 kV 的条件下，固定缓冲液浓度为10 mmol /L ，考察缓冲溶液pH 值在3.0～7.0范围内对2 种生物碱的分离度和发光强度随缓冲液pH
值变化的关系，如图3所示，当pH 值为5.74时，荷叶碱与莲心碱的分离度和发光强度最佳且峰形较好，因此选择磷酸盐缓冲溶液pH 值为5.74。

2.4
缓冲液浓度的影响
㕃 ⏢⎃ /˄mmol/L ˅
图 4
缓冲液浓度对发光强度的影响
Fig. 4 Effect of buffer concentration on ECL intensity
在分离电压为13 kV ，进样电压为8 kV ，进样时间为10 s ，检测电位为1.20 V 的条件下，考察将磷酸盐缓冲液的pH 值固定为5.74时，其浓度在5～15 mmol /L 范围内变化对发光强度的影响。

如图4所示，发光强度随着缓冲液浓度的增加逐渐升高，当浓度为10 mmol /L 时，荷叶碱和莲心碱的发光强度达到最大。

当浓度高于10 mmol /L 时，两者发光强度逐渐降低，基线不稳定，信噪比变差，迁移时间也变长，因此选择10 mmol /L 的磷酸盐缓冲液作为测定荷叶碱和莲心碱的最适浓度。

2.5
检测池中磷酸盐缓冲液pH 值的影响
1 2001 000800600400
200
⼧䞨ⴀ㕃 ⏢pH
图 5
检测池中磷酸盐缓冲液pH 值对发光强度的影响
Fig. 5
Effect of detection phosphate buffer pH value on ECL intensity
在检测电位为1.20 V ，10 mmol /L 磷酸缓冲液为运行缓冲液，进样电压为8 kV 和进样时间为10 s 条件下，固定磷酸盐缓冲液浓度60 mmol /L ，当检测池中磷酸盐缓冲液pH 值在6.0～9.0范围内变化时，荷叶碱和莲心碱的发光强度也随之发生变化。

如图5所示，当pH 值较小时，发光强度较小，随着pH 值的增大，发光强度增大。

当荷叶碱pH 值为8.30时，发光强度达到最大值；莲心碱pH 值为8.50时，发光强度达到最大。

当荷叶碱pH 值大于8.30、莲心碱pH 值大于8.50时，发光强度逐渐减少，综合考虑两者的发光强度，选择8.30为最佳pH 值。

2.6
进样时间及进样电压的影响
采用电动进样，选择进样电压为10 kV 考察不同进样时间（6～14 s ）对发光强度的影响，在6～10 s 之间，随着进样时间的延长，发光强度逐渐升高，当进样时间为10 s 时发光最大，因此选择进样时间为10 s 。

固定进样时间10 s ，考察不同进样电压（6～12 kV ）对发光强度的影响，进样电压为8 kV 时，具有最大发光强度。

当进样时间大于10 s 、进样电压大于8 kV 时，会引起区带展宽，导致柱效降低，因此本实验选择进样时间为10 s ，进样电压为8 kV 。

2.7 分离电压的影响
考察荷叶碱和莲心碱分离电压在10～16 kV 范围内变化时对发光强度的影响，当电压从10 kV 升高到13 kV 时，荷叶碱和莲心碱的发光强度都在不断增强，电渗流速率变大，两者的迁移时间逐渐变短，当分离电压大于13 kV 时，荷叶碱和莲心碱发光强度逐渐降低。

可能的原因是分离电压升高，毛细管产生的焦耳热增多，噪音增大，高的分离电压使毛细管中的分析物流出速度加快，
会稀释电极表面Ru(bpy)33＋
浓度，使发光强度降低，因此
选择13 kV 作为最佳分离电压。

2.8 线性范围、检出限与精密度结果
在优化的分离和检测条件下，对荷叶碱和莲心碱标准品进行了CE-ECL 分离检测，如图6所示。

2 种生物碱在10 min 内能可实现良好的检测，峰形好且有较强的发光强度。

以发光强度的峰面积对荷叶碱和莲心碱作工作曲线，如表1所示。

实验对浓度为6.8×10－5 mol /L 荷叶碱
和3.1×10－5 mol /L 莲心碱标准品连续进样测定5 次，荷叶碱峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation ，RSD ）为3.76%，迁移时间RSD 为
0.83%。

莲心碱峰面积RSD 为4.28%，迁移时间RSD 为1.37%。

3 0002 5002 0001 5001 00050000
100
200
300
400
500
䰤/s
a 2 0001 8001 6001 4001 2001 000800600400 䰤/s
b 图 6 荷叶碱（a ）和莲心碱（b ）标准品的CE-ECL 图Fig. 6
CE-ECL electropherograms of nuciferine (a) and
liensinine (b) standards 表 1
方法的线性范围和检出限
Table 1 Linear ranges and detection limits of the proposed method 标准品线性范围/（mol /L ）
线性回归方程相关系数r 检出限/（mol /L ）荷叶碱
1.7×10－5～3.4×10－4 y =94.972x ＋399.270.999 17.7×10－7莲心碱
1.6×10－6～7.1×10－5
y =424.73x ＋535.240.998 47.8×10－7
2.9 样品的测定及回收率实验结果
如图7所示，图7A 出现的几个发光峰中与荷叶碱标准
样品谱峰出峰时间一致的是峰1，经加标确认后峰1是荷叶碱。

相对于图7B 中只出现一个峰，与莲心碱标准样品的电泳图中出峰时间一致，经确认后图7B 图中的峰1为莲心碱。

测出该荷叶药材含荷叶碱的含量达0.097%，莲子心药材含莲心碱含量达0.24%。

如表2所示，荷叶碱的回收率在93.0%～98.71%之间，回收率的平均RSD 为3.7%，莲心碱的回收率在90.0%～96.5%之间，回收率的平均RSD 为4.1%。

1 8001 6001 4001 2001 000800600400200
100200300400500600
䰤/s
发光强度A
1
3
21.荷叶碱；2、3为未知峰。

B 1 8001 6001 4001 2001 000800
100
200
300400
500
600
700
䰤/s
1
1.莲心碱。

图 7 荷叶（A ）与莲子心（B ）样品电泳图Fig. 7
Electropherograms of real samples
表 2
样品的测定结果和回收率（n =5）
Table 2 Concentrations and recovery rates of the analytes (n = 5)
分析物
样品质量浓度/（μg /mL ）加标量/（μg /mL ）测得值/
（μg /mL ）
回收率/%
RSD /%
荷叶碱9.23 1.010.1693.09.23 5.014.0897.0 3.7
9.237.016.1498.7莲心碱
14.55
1.015.4590.014.55
2.016.4896.5 4.1
14.55
5.0
19.30
95.0
3 结 论
本实验通过对测定条件的优化，建立了同时测定荷叶碱和莲心碱的CE-ECL 方法，并将其应用于荷叶和莲子心中的荷叶碱和莲心碱的含量分析。

该法能在10 min 内实现良好的分离检测，该法具有简单、高效、快速、耗试剂少等优点，不仅对扩展荷叶碱和莲心碱的含量测定方法具有重要意义，而且为其他有类似相同结构的生物碱研究提供理论依据。

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