蛋白质的定量测定—福林-酚试剂法

蛋白质的定量测定—福林-酚试剂法
一、实验目的：
1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量。

3、掌握分光光度计的使用方法。

二、实验原理：
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。

甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。

蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成蛋白-Cu2+紫红色络合物。

乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸,硫酸,溴等组成。

此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈深蓝色反应，在一定条件下，深蓝色强度与蛋白质浓度成正比。

三、实验步骤：
取洁净干试管7支，按下表操作：
30分钟后，以空白管对照，于660nm处比色，读取吸光度值。

四、结果与分析：
1.吸光度A660值表
2.绘制标准曲线
以纵座标为吸光度，横座标为蛋白质浓度，绘制标准曲线，如下图：
由图可知直线方程为y=5.6741x，待测管吸光度值为0.105，即y=0.105时，x=0.105/5.6741=0.0185g/L
样品蛋白浓度（g/L）=0.0185×6.5×500=60.13g/L
3.标准管法求浓度
2号标准管与待测管吸光度相近，代入公式计算：
样品蛋白浓度（g/L）=(0.105/0.087)×0.25×(0.4/1.0)×500=60.34g/L
五、讨论
1.如果只用乙试剂而不用甲试剂，也可以发生颜色反应，只是所要耗费时间较长。

2.甲试剂在本实验中起提供碱性环境的作用，其中的Cu2+还起到类似于催化剂作用，使反应更快显色。

3.福林-酚试剂法的主要缺点在于此法对蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量有要求，如果没有酪氨酸和色氨酸的话就无法显色。

4.所用试管一定要干净、干燥，否则即便是微量也会对反应体系造成影响，影响颜色变化，最终影响吸光度的测定。

5.加入试剂乙混匀后静置30min，使氧化还原反应充分反应。

6.设置空白管是为了排除除了所要测量物质以外的所有溶剂对吸光度的影响，本实验要测物质为蛋白质。

7.加入试剂乙后要立即混匀，因为Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成紫色络合物，故一定要保证磷钼酸、磷钨酸试剂在被中和前与前一步产生的络合物中的酪氨酸发生反应。

否则最后生成的有色物质可能会很
少，吸光度会很低。

8.测量的时候要从低浓度到高浓度测。

如果润洗不干净，高浓度溶液对低浓度溶液影响较大，而低浓度溶液对高浓度溶液影响不大。

六、结论
本实验利用福林酚法测定牛血清白蛋白浓度，用标准曲线法测得浓度为60.13g/L，用标准管法测得为60.34g/L。

七、临床意义
血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分的分布情况,在机体脱水的情况下,血清总蛋白质含量升高，而在机体发生水肿时,血清蛋白含量下降,所以测定血清蛋白质含量具有临床意义。