基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
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TAL 靶点识别模块
X2
FokI
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TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率编辑升pp高t 几个数量级
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TALEN的最前沿
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TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases,类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具,现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
技术原理:
表达一个重组核酸酶,在靶点识别结构域的作用下,核酸酶识别 靶点核酸序列,并发挥内切酶活性,从而打断目标基因,完成基 因敲除的过程。
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(三)诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统 为基础,利用控制Cre表达的启动子的活性 或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点, 通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物 的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定 基因的敲除。
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• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的,基因 组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因 动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所 表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动 物基因敲除的时空特异性进行人为控制,以避免出 现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随 机交换,但在体细胞内,基因同源重组的效率特别低(低于106),增加了实际操作的工作量,限制了该项技术的应用。
1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠
模型,此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善,目前该技
术已经成为研究基因功能最直编接辑pp、t 最有效的方法之一。
• 片段删除
• 片段插入
目的与用途:生物模型;表达工具;基因治疗
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靶向基因技术
• 经典方法 :
– 自杀质粒,同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells),难!
• 饱含希望与失望的技术:
– ZFN,被Sigma公司垄断
• 新的里程碑:
– TALEN
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• 常见的几种诱导型基因敲除类型有:四环素诱导型; 干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
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III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
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(一)ZFN技术系统
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ZFN 技术原理
锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)是人工改造的限制性核酸内 切酶,利用不同的锌指结构识别特异DNA序列,利用核酸酶切断靶DNA。
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TALEN 发展过程
• 1989年 植物病原体黄单胞菌属 (Xanthomonas spp.)
avrBs3 基因被克隆。
• 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性, avrBs3 – TA
• 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列 的对应关系被破译
由34个aa组成一个单元模块,重复17 -18次
34个aa中的第12和13个氨基酸(Repeat Variant Di-
residue, RVD) 对应识别一个目标碱基
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人工构建TALE模块识别指定核酸序列
102碱基模块单元
…… 14 – 18个重复 真核表达
34氨基酸单元
…… 14 – 18个重复
特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
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条件型基因打靶的优势: 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点: 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变,可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 该系统在80年代被引入后,已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛 应用,是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时 空特异性基因打靶策略的技术核心。
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Cre-LoxP重组酶系统
• Cre重组酶:于1981年从P1噬菌体中发现,属于λ Int酶超 基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp (EMBL数据库登录号X03453),编码38kDa蛋白质。 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它不 仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的 DNA 序列,即 loxP 位点,使 loxP位点间的基因序列被 删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率,不借助任何 辅助因子,可作用于多种结构的 DNA 底物,如线形、环 状甚至超螺旋 DNA。
博士专题:基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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II、基因敲除:可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除,又称基因打靶,是一种遗传工程技术,是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组,能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上,从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
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Cre-LoxP-overP1)序列:来源于P1噬菌体,是 有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成, 8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化 DNA链交换过程中与DNA共价结合,13bp的反向重复序 列是Cre酶的结合域。其序列如下 :
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
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• Cre-LoxP系统的特性
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条件性基因敲除法可定义 为将某个基因的修饰限制 于小鼠某些特定类型的细 胞或发育的某一特定阶段 的一种特殊的基因敲除方 法。它实际上是在常规的 基因敲除的基础上,利用 重组酶Cre介导的位点特异 性重组技术,在对小鼠基 因修饰的时空范围上设置 一个可调控的“按钮”, 从而使对小鼠基因组的修 饰的范围和时间处于一种 可控状态。
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
2011年8月, Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章,另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
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(一)完全基因敲除
• 基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因 等)的载体上,成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能,所以一般设计为替换型载体。
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基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制:
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Cre/loxP系统编辑作ppt用原理示意图
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FLP/FRT 系统
• 该系统与Cre/loxP系统相同,也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑,Flp/FRT系统是Cre/loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中,重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似,Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子,同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target,FRT)与loxP位点非常相似, 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时,FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同,Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃,而Flp重组酶为30℃。 因此,Cre/loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
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ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑,比如基因 敲除。已建立有ZFN库,识别多种DNA序列,但还不能达 到识别任意靶DNA的目的,其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介编辑导p的pt 定向染色体删除
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• ZFN技术已成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、 中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、 烟草、玉米、猪、牛、人类iPS细胞等,此外,该 技术已经有用于治疗HIV的ZFN药物进入二期临床 实验。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基;
• 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列,通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基, TGEK是多个螺旋间的连接序列;
• 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白(ZFN)可以在指定区域切断 DNA双链。
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• 单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3-6个Cys2-His2锌 指结构域,每个锌指结构域能特异识别1个三联体碱基, 与锌指蛋白相连接的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端 96个氨基酸残基组成的DNA剪切域,每个FokI单体与一 个锌指蛋白组相连构成一个ZFN,识别特定的位点,但2 个识别位点相距6-8bp距离时,2个单体ZFN相互作用产生 酶切功能。在此特异位点产生1个DNA双链切口,然后利 用固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修 复。从而达到对精确位点进行定点修饰的目的。
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TALEN 发展过程
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TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点
切割诱发DNA损伤修复机制 (nonhomologous end-joining, NHEJ)。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
• 但是,该技术制备复杂,成本昂贵,而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
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(二)
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崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN
经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• (点)突变:Silent;Missense; Nonsense;Frame shift (基因敲除, Knockout)
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• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导 型基因敲除。
• 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个 体中的靶基因活性。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空 间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制,在动物 的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲 除的技术。
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡,使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能;某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能,完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型,使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的,还是由几种细胞共同引起的。
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(二)条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。