实验一 动物细胞蛋白质的提取和含量测定

实验一动物细胞蛋白质的提取和含量测定
实验目的：学习动物细胞蛋白质的提取方法，并利用比色法测定蛋白质含量。

实验原理：
蛋白质是生物体中丰富的一类生物大分子，广泛分布于细胞内和细胞外，并参与生物体内多种生命过程。

动物细胞蛋白质的提取是分离蛋白质与其他细胞成分的过程，主要包括以下步骤：细胞破碎、离心、过滤、沉淀、溶解等。

比色法是常用的蛋白质含量测定方法，其基本原理为：在一定条件下，吸收光谱的特定波长处与蛋白质浓度成正比关系，当分子光吸收强度与物质的摩尔吸光系数（ε）和浓度（c）成比
例时，吸收光强度与摩尔浓度成正比。

实验材料：
鼠肝组织（或其他动物细胞）、PBS缓冲液、离心管、低速离心机、高速离心机、比色皿、分光光度计、升酸钠（NaOH）、双氧水（H2O2）、标准蛋白溶液。

实验步骤：
1.将肝组织切碎并加入PBS缓冲液中，用器皿以适量缓慢但均匀的方式搅拌，使细胞尽可能充分破碎，制成15%（w/v）的
组织均浆。

2.将组织均浆经低速离心（1000×g，5分钟）离心去除大的组织碎片和细胞核，得到上清液。

3.取出上清液，经高速离心（12000×g，10分钟）离心，得到上清液中的细胞蛋白质沉淀。

将上清液去除，并将沉淀用PBS缓冲液洗涤2-3次。

4.将蛋白样品溶解在PBS溶液中，并将其含量测量。

用比色法测量蛋白质的含量。

5.将一定量的标准蛋白质溶液（如蛋白质量为0.5mg/ml）放入比色皿中，取等体积的PBS作为对照。

将吸收光谱测试于580nm光波下。

6.将需要测定的试样溶液（不稀释或稀释到正常范围内）的吸光度值与标准曲线进行比较，并评估试样的蛋白质含量。

实验注意事项：
1.组织均浆可以通过超声波等方式进行更好的细胞破碎。

2.在高速离心前，一定要充分清除离心管内假底残留的上清液及杂物。

3.比色法中，在标准曲线制备过程中，须注意所有物品洁净，不受污染。

标准品配制同样须严格控制。

实验结果：
在蛋白质提取和测定后，实验者可计算并评估其蛋白质含量。

一般而言，正常细胞蛋白质质量多少可能会因试验条件、细胞来源等原因产生细微或明显差异，需按照实验制定的标准，对蛋白质含量计算加以评定。

同时，要注意将提取的蛋白质制备按照尽早分装并尽快使用的原则进行保存。