芒果甙对柔红霉素中毒心肌细胞SERCA2α、PLB表达的影响

芒果甙对柔红霉素中毒心肌细胞SERCA2α、PLB表达的影响
发表时间：2013-04-08T09:06:27.077Z 来源：《医药前沿》2013年第4期供稿作者：余邦伟彭志刚殷万斐[导读] 柔红霉素（DNR）是一种临床上常用的蒽环类抗肿瘤药物，但随着其药物剂量的加大，心脏毒性发生率也随之增高
余邦伟彭志刚（通讯作者）殷万斐（广西医科大学第一附属医院血液内科广西南宁 530021）【摘要】目的：利用柔红霉素复制新生大鼠心肌细胞中毒模型，观察芒果甙对中毒心肌细胞SERCA2α及PLB表达的影响，探讨芒果甙保护心肌细胞的机制。

方法：取原代培养心肌细胞以4μmol/L柔红霉素（Daunorubicin, DNR）建立心肌细胞中毒模型，以不同浓度芒果甙(25、50、100μmol/L)干预，用RT-PCR方法检测心肌细胞肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA2α）及磷酸受钙蛋白（PLB）的mRNA表达水平的变化，用免疫组化方法检测Ca2+-ATP酶（SERCA2α）及磷酸受钙蛋白（PLB）的蛋白水平的变化。

结果：与空白对照组相比，柔红霉素模型组SERCA2αmRNA及蛋白的表达减低(P<0.01)，而其PLBmRNA及蛋白的表达增高(P<0.05)；与柔红霉素模型组相比，各浓度芒果甙给药组能增加SERCA2αmRNA及蛋白的表达，降低PLBmRNA及蛋白的表达（P<0.05）。

结论：芒果甙能影响SERCA2α、PLB的表达，这可能是芒果甙能减轻柔红霉素诱导的心肌毒性的机制之一。

【关键词】芒果甙柔红霉素钙超载 SERCA2α 磷酸受钙蛋白（PLB）
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）04-0044-02 柔红霉素（DNR）是一种临床上常用的蒽环类抗肿瘤药物，但随着其药物剂量的加大，心脏毒性发生率也随之增高，限制了其在临床上的应用。

目前，蒽环类化疗药物的心脏毒性的具体机制尚不十分清楚。

研究表明，由蒽环类化疗药物引起的心肌细胞内钙超载是导致心脏毒性的机制之一。

钙超载可以促进活性氧的生成，并促进心肌细胞凋亡，导致心肌细胞能量代谢异常。

Ca2+在心肌兴奋-收缩耦联中起关键作用。

SERCA2α是心肌细胞肌浆网上的Ca2+-ATP酶，是心肌Ca2+调控的重要机制。

PLB是对SERCA2α直接发挥调节作用的钙调节蛋白，PLB能降低SERCA-2α与Ca2+的亲和力从而抑制SERCA2α活性。

阿霉素（DOX）能下调心肌细胞肌浆网Ca2+-ATP酶的表达[1]。

本研究选用体外培养新生SD大鼠心肌细胞复制DNR中毒模型，观察芒果甙对DNR中毒心肌细胞SERCA2α、PLB表达的影响的影响，探讨芒果甙保护心肌细胞的机制。

1 材料与方法
1.1 主要试剂 DMEM/Haf12培养基购自Hyclone公司、胎牛血清购自杭州四季青公司，胰酶购自Solabio公司，总RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，cDNA第一链合成试剂盒及SYBR Green qPCR Master Mix购自Fermentas公司，免疫组化二抗试剂盒、DAB显色剂、SERCA2α、PLB抗体购自武汉博士德公司，芒果甙由广西民族医学院研究所中心实验室提供，纯度为99.5%，2%NaHCO3配制10mmol/L，-20℃冻存。

1.2 实验动物出生1-3天SD大鼠乳鼠，雌雄不限，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.3 方法
1.3.1 DNR中毒心肌细胞模型的建立及实验分组参照文献方法[2]体外培养大鼠心肌细胞，培养至细胞生出伪足连接成片后供实验用。

将体外培养的心肌细胞随机分为5组（n=10）：空白对照组、DNR模型组（将DNR加入培养液中，终浓度为4μmol/L）、25μmol/L芒果甙+DNR模型组（芒果甙组1）、50μmol/L芒果甙+DNR模型组（芒果甙组2）、100μmol/L芒果甙+DNR模型组（芒果甙组3）,药物干预24小时。

1.3.2 RT-PCR检测SERCA2α和PLBmRNA表达用Trizol抽提心肌细胞总RNA，再逆转录为cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增。

取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将SERCA2α、PLB和β-actin所测灰度值之比作为SERCA2α、PLB表达数值进行半定量分析。

1.3.3 免疫组织化学的方法(SABC法)检测SERCA2α、PLB蛋白表达取灭菌的盖玻片分别放入培养板中，滴心肌细胞悬液在盖玻片上培养。

待心肌细胞贴壁并伸出伪足爬满盖玻片后，将细胞爬片取出自然晾干，依照试剂盒说明步骤操作，最后中性树胶封片，晾干后显微镜观察。

免疫组化结果应用Image Pro Plus 6.0图像分析系统进行免疫组化图象分析，标准光密度值值校正，每张切片以10个视野平均光密度的平均值作为这张切片的测量值。

1.3.4 统计学处理所有数据以均数±标准差（X-±S）表示，采用SPSS13.0统计软件进行组间单因素方差分析比较，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果
2.1 不同浓度芒果甙对DNR中毒心肌细胞中SECRCA2α及PLB mRNA表达的影响与空白对照组相比，柔红霉素模型组SECRCA2αmRNA表达明显减低（P＜0.01），PLBmRNA表达增高（P＜0.05）；与柔红霉素模型组相比，不同浓度的芒果甙+柔红霉素组均可上调SECRCA2αmRNA的表达及下调PLBmRNA的表达（P＜0.05），并随着芒果甙浓度的增加，影响更明显。

结果见表1。

表1 芒果甙对DNR中毒大鼠心肌细胞SECRCA2α及PLB mRNA表达的影响
2.2 不同浓度芒果甙对DNR中毒心肌细胞中SECRCA2α及PLB 蛋白表达的影响与空白对照组相比，柔红霉素模型组SECRCA2α蛋白表达量减低（P＜0.05），PLB蛋白表达增高（P＜0.05）；与柔红霉素模型组相比，芒果甙组SECRCA2α蛋白的表达量增高，并呈剂量依赖效应（P＜0.05），而芒果甙PLB蛋白的表达量较柔红霉素模型组是减低的（P＜0.05），并随着芒果甙浓度的增加，PLB蛋白的表达量是逐渐减低的。

结果见表2。

表2 芒果甙对DNR中毒大鼠心肌细胞SECRCA2α及PLB蛋白表达量的影响
3 讨论
柔红霉素的心脏毒性机制主要有氧化应激产物生成、钙超载、铁离子代谢紊乱、柔红霉素醇代谢物等几种学说。

蒽环类化疗药物能增加心肌细胞肌浆网（SR）上钙离子释放通道的开放率，抑制Na+-Ca2+交换，激活L-型心肌细胞钙离子通道，DOX能下调心肌细胞肌浆网Ca2+-ATP酶的表达，导致心肌细胞钙超载，继而引起线粒体钙超载，影响能量代谢，促进ROS的产生。

此外，心肌细胞内钙离子浓度的增高能促进ROS的产生，并通过开放线粒体通透性转换孔调节线粒体膜通透性，从而释放细胞色素C促进细胞凋亡。

所以钙超载是蒽环类化疗药物的心脏毒性机制中非常重要的一环。

本实验中，我们观察到柔红霉素中毒心肌细胞的SERCA2α基因表达水平相对于空白对照明显
下降，与文献报道一致。

Ca2+在心肌兴奋-收缩耦联中起关键作用，SR通过调节心肌细胞内游离钙离子浓度，来控制心肌的收缩与舒张。

心肌收缩时，90%的Ca2+浓度的升高由SR释放，舒张期胞浆内钙离子浓度的降低有70%-75%也是由SR摄取并贮存。

肌浆网Ca2+摄取的两个关键因素是SERCA和PLB。

在衰竭心脏中异常的Ca2+循环可以通过提高SERCA的活性来矫正。

PLB/SERCA2α的比值改变直接反应心功能的变化。

故增强SERCA2α的表达，降低PLB/SERCA2α比值，可以改善心脏功能。

有实验证明，丹参总酚酸[3]能上调SERCA2α基因表达，减轻心肌细胞钙超载。

抗氧化药物如α-硫辛酸及维生素E能降低心肌细胞内钙离子浓度。

芒果甙属于黄酮类化合物，有抗氧化、抗肿瘤、强心等多种作用。

芒果甙能通过清除心肌细胞内活性氧从而减轻过氧化损伤[4]，还能通过影响铁调节蛋白1及铁调节蛋白2的表达水平以恢复心肌细胞内正常铁代谢[5]，抑制柔红霉素诱导的心肌细胞凋亡[6]，发挥对大鼠柔红霉素中毒心肌细胞的保护作用。

芒果甙对心肌细胞钙超载的影响尚不清楚。

本实验结果显示，芒果甙能下调SERCA2α基因表达，上调PLB基因表达，降低降低PLB/SERCA2α比值，并且呈现剂量依赖效应。

我们可以推测，芒果甙能通过对SERCA2α及PLB表达的影响，抑制钙超载，对柔红霉素中毒心肌细胞起到保护作用。

但芒果甙对心肌细胞内存在的其它钙调节通路如兰尼碱受体钙通道、L型Ca2+通道等的影响，以及芒果甙干预后细胞内钙离子浓度的具体变化情况，目前尚不清楚，有待进一步实验研究探讨。

随着对芒果甙药理作用更深入的研究，其临床应用前景是巨大的。

参考文献
[1]Santos DL,Moreno AJ,Leino RL et al.Carvedilol protects against doxorubicin-induced mitochondrial cardiomyopathy[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2002,185(3):218-227.
[2]郭勇, 张西正, 魏严等. 新生大鼠心肌细胞的体外培养和生物学观察[J]. 生物医学工程研究, 2006,(4):259-262.
[3]邢永发,姬艳苏,张玲等.丹参总酚酸对慢性心衰大鼠肌浆网Ca～(2+)-ATP酶、受磷蛋白表达的影响[J]. 辽宁中医杂志,2011,01:162-164.
[4]吴泽广，彭志刚，杨杰等. 芒果甙对柔红霉素致大鼠心肌细胞过氧化损伤的保护作用[J].中药药理与临床, 2011;27(2):37～40.
[5]石泽延,彭志刚,马劼等.芒果甙对柔红霉素致大鼠心肌毒性细胞中铁调节蛋白表达的影响[J].广西医科大学学报,2012,29(2):169-171.
[6]李轶瑜,彭志刚,吴泽广等.芒果甙所致柔红霉素所致大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用[J]. 中药药理与临床,2012,2,(35)：274-278.基金项目：广西自然科学基金项目资助（合同号：2010GXNSFA013177）。