备课素材：线粒体自噬的机理 高一上学期生物人教版必修1

线粒体自噬的机理
先看一道试题：
细胞内受损后的线粒体释放的信号蛋白，会引发细胞非正常死亡．如图表示细胞通过“自噬作用”及时清除受损线粒体及其释放的信号蛋白的过程，请据图回答：
（1）吞噬泡的吞噬过程体现了生物膜在结构上具有的特点．图中自噬体由层磷脂分子构成（不考虑自噬体内的线粒体）．
（2）受损线粒体的功能逐渐退化，会直接影响有氧呼吸的第
阶段．细胞及时清除受损的线粒体及信号蛋白的意义是．（3）（3）研究发现人体细胞溶酶体内的pH在5.0左右，由此可知细胞质基质中的H+进入溶酶体的运输方式是．（4）图中水解酶的合成场所是．自噬体内的物质被水解后，其产物的去向是．由此推测，当细胞养分不足时，细胞“自噬作用”会（增强/减弱/不变）．
解析：阅读题干和题图可知，本题以线粒体的“自噬作用”为材料考查溶酶体在维持细胞内稳态的过程中所起的作用，先分析题图了
解线粒体“自噬作用”的过程和涉及的相关知识，然后结合问题的具体要求综合解答．
由题图可知，吞噬泡的吞噬过程存在膜的变化，体现了生物膜在结构上具有一定的流动性；图中自噬体是两层膜包裹着线粒体，若不考虑自噬体内的线粒体，自噬体由4层磷脂分子组成．
（2）线粒体是有氧呼吸的主要场所，在线粒体中进行有氧呼吸的第二、三阶段，所以受损线粒体的功能逐渐退化，会直接影响有氧呼吸的第二、三阶段；由题意可知，细胞内受损后的线粒体释放的信号蛋白，会引发细胞非正常死亡，细胞及时清除受损的线粒体及信号蛋白的意义是维持细胞内部环境的相对稳定，避免细胞非正常死亡．（3）由题意可知，H+从细胞质基质进入溶酶体是逆浓度梯度运输，因此属于主动运输．
（4）水解酶的本质是蛋白质，蛋白质合成的场所是核糖体，自噬体内的物质被水解后，形成产物的对细胞有用的物质又被细胞利用，对细胞无用甚至有害的物质被排出细胞外；当细胞养分不足时，细胞“自噬作用”会增强，以为细胞提供更多的营养物质．
答案：（1）流动性4（2）二、三避免细胞非正常死亡（维持细胞内部环境的相对稳定）（3）主动运输（4）核糖体排出细胞外或细胞内利用增强
这道试题以线粒体与细胞“自噬作用”为素材考查细胞结构和功能。

那么，线粒体与细胞“自噬作用”的机理是怎样的？
线粒体通过氧化磷酸化以ATP的形式产生能量。

由于氧化磷酸化的缺陷会产生有害的活性氧，因此通过一种称为线粒体自噬的选择性自噬形式有效去除受损的线粒体是很重要的。

由于细胞生物学、结构和蛋白质组学方法的结合，我们开始了解泛素依赖性信号标记受损线粒体进行线粒体自噬的机制。

这篇综述讨论了通过PTEN诱导的推定激酶1（PINK1）和E3泛素蛋白连接酶parkin 促进泛素与受损线粒体结合的生化步骤和调节机制，以及泛素链如何促进自噬体捕获。

最近发现的parkin和PINK1在抑制线粒体抗原呈递中的作用为该途径如何促进神经元存活提供了替代模型。

对这些过程的更深入理解对神经退行性疾病有重要意义，包括帕金森病，在帕金森病中，线粒体自噬和其他形式的选择性自噬缺陷突出。

Figure 1. Parkin依赖的线粒体自噬概况
线粒体在细胞和生物体的生活中发挥着核心作用，通过氧化磷酸化以ATP的形式作为能量产生中心，并通过组织代谢机制，如柠檬酸循环，驱动许多细胞功能。

线粒体的空间组织是其功能的关键，其中氧化磷酸化通过线粒体内膜中的呼吸链发生，其他代谢反应在线粒体基质中组织。

线粒体蛋白质由细胞核和线粒体基因组编码，需要通过线粒体外膜和内膜精确协调蛋白质输入，折叠和组装成蛋白质复合物，最终形成功能性的空间组织细胞器。

这些过程中的错误会导致线粒体受损，对细胞生理学有害。

例如，呼吸链功能的缺陷会促进破坏性活性氧的产生和对线粒体功能至关重要的膜电位的丧失。

此外，基质中蛋白质折叠的缺陷促进线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，mtUPR），后者控制线粒体基质中的蛋白质合成和线粒体伴侣蛋白的产生。

尽管当损伤比较短暂时，mtUPR等稳态机制可能足以修复线粒体，但长期或不可修复的损伤可以通过线粒体自噬过程导致线粒体的消除。

线粒体自噬是一种选择性自噬形式，在此过程中，线粒体被聚泛素链修饰，被自噬体吞噬，并在溶酶体融合后降解（Figure 1）。

线粒体自噬最初是在培养细胞的电子显微照片中观察到的，过去二十年的工作揭示了线粒体通过泛素依赖和泛素非依赖途径靶向自噬系统的基本生化步骤。

作者对泛素依赖性线粒体自噬的理解主要是通过分析两个在家族性帕金森病中被发现突变的基因
来推动的——E3泛素蛋白连接酶parkin（PRKN）及其活化激酶PTEN诱导的推定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1），该激酶存在于受损的线粒体上。

对黑腹果蝇的早期研究揭示了PINK1在parkin上游发挥作用的遗传学途径，parkin的过度表达可以绕过PINK1的缺陷。

现在知道，这些蛋白质以一种共同的途径运作，催化线粒体外膜（mitochondrial outer membrane，MOM）蛋白上泛素链的组装。

这些泛素链结合自噬货物受体，如视神经磷酸酶（optineurin，OPTN）和螯合体1（sequestosome 1，SQSTM1，也称为p62），它们与一般的自噬机制协同作用，捕获自噬体双膜中受损的线粒体（Figure 1）。

与溶酶体融合并通过溶酶体水解酶促进线粒体的降解。

最近发现，OPTN和SQSTM1，以及它们相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶TBK1，在基因上与肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的散发和家族形式有关。

这种遗传联系有两个主要含义：第一，它表明选择性形式的自噬是特定形式ALS的基础，第二，它表明了解标记自噬货物（包括线粒体）连同泛素及其被货物受体捕获的生化机制，可能为神经退行性疾病的治疗干预开辟新的途径。

除了这些对疾病的影响外，最近的研究表明，某些形式的parkin介导的线粒体自噬清除了明显健康的线粒体，这对几个生理过程很重要，例如血管生成素1受体（TIE2）阳性造血干细胞的自我更新，以及受精过程中父亲的线粒体清除
（BOX 1）。

此外，parkin与结核分枝杆菌的异种吞噬清除有关，这可能与线粒体自噬相似，但其潜在机制尚不清楚。

在这篇综述中，作者重点关注驱动泛素链在受损线粒体上组装的生化机制，以及泛素化是如何被自噬机制解码以捕获受损细胞器的。

鉴于线粒体不断参与融合-分裂循环，可能会混合健康和受损的细胞器，线粒体自噬途径在选择性标记和降解受损细胞器的能力方面快速而稳健是很重要的。

这种选择性是通过使用两个不同的、顺序的前馈环来实现的，这两个前馈环由线粒体表面的激酶PINK1和泛素ubiquitin驱动，预计它们会产生开关样行为，仅用于检测和捕获受损的细胞器。

作者描述了泛素依赖形式的线粒体自噬的可推广框架，并讨论了对这些关键途径的理解中存在的实质性差距。

发育过程中的线粒体自噬和通过parkin非依赖机制
人们越来越认识到，除了去除有缺陷的线粒体外，在发育和正常生理过程中发生的特定细胞转变过程中，线粒体丰度的大幅改变也是必要的（见下图）。

在秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇和脊椎动物的受精过程中，父系线粒体DNA的丢失是通过线粒体自噬过程发生的。

在小鼠中，E3泛素蛋白连接酶parkin和线粒体泛素连接酶激活因子NFKB 1（mitochondrial ubiquitin ligase activator of NFKB 1，MUL1）与螯合体1（sequestosome 1，SQSTM1）和PTEN诱导的推
定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）联合发挥冗余功能，表明在这种情况下使用了已建立的PINK1-parkin途径的一些元素。

相比之下，黑腹果蝇的类似过程需要自噬机制和SQSTM1，但不需要parkin直系同源物。

为了在网织红细胞成熟过程中去除线粒体，捕获线粒体的自噬体组装由位于线粒体外膜（MOM）上的一种名为BCL2/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白3样（BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like，NIX；也称为BNIP3L）的自噬受体协调，含有用于与ATG8蛋白相关的LC3相互作用区（LC3-interacting region，LIR）基序，是线粒体有效清除所必需的。

最近的数据表明，LIR基序附近NIX的磷酸化增加了与ATG8的结合，并增加了线粒体的自噬体募集。

其他含有LIR基序的MOM 蛋白，包括肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP8和含有FUN14结构域的蛋白1（FUN14 domain-containing protein 1，FUNDC1），与ATG8蛋白的直接相互作用有关，以促进线粒体自噬。

在缺乏parkin 的情况下，FKBP8和ATG8蛋白LC3A的过表达可以促进线粒体自噬，尽管这种形式的线粒体自噬的生理环境尚不清楚。

类似地，FUNDC1的过表达可以通过E3泛素蛋白连接酶MARCH5调节的方式促进对缺氧的线粒体自噬。

了解ATG8募集用于促进直接线粒体自噬的生理环境仍然是未来研究的目标。

PINK1-parkin通路综述
普遍认为，线粒体上泛素链的组装对于这种自噬机制的补充和线粒体自噬清除受损的线粒体是必要的。

在最简单的形式中，泛素链组装途径可以描述为包含三个积极作用的元件：线粒体损伤传感器（PINK1）、信号放大器（parkin）和信号效应器（泛素链），其决定哪些线粒体应该被自噬机制捕获（Figure 1）。

PINK1包含一个N末端线粒体靶向序列，并与外膜转位酶（translocase of the outer membrane，TOM）复合物结合。

当PINK1的线粒体靶向序列和跨膜片段到达内膜转位酶（translocase of the inner membrane，TIM）复合物并横向转移到内膜时，跨膜片段被内膜定位蛋白酶PARL（早老素相关菱形样蛋白，presenilins-associated rhomboid-like protein，线粒体）蛋白水解切割。

切割产生含有激酶结构域的52kDa蛋白质片段，该激酶结构域可能仍与TOM复合物相关联。

当线粒体健康时，这一52 kDa的PINK1片段被释放到胞质溶胶中，并被N端规则泛素连接酶（N-end rule ubiquitin ligase）快速泛素化，该连接酶将其靶向蛋白酶体降解。

因此，在具有健康线粒体的细胞中PINK1水平较低。

然而，当线粒体受损时，PINK1易位和加工被阻断，导致活性PINK1在MOM上积累，它可以通过多步前馈机制激活parkin的E3泛素连接酶活性，详见后面所述。

组装在MOM上的parkin依赖性泛素链随即促进泛素结合线粒体自噬受体的募集，以促进自噬体的捕获（Figure 1）。

与大多数信号转导途径一样，负调节因子有助于确保损伤信号足够强，从而使健康的线粒体不会被不适当地降解。

在这种线粒体自噬途径中，去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs），包括线粒体定位的泛素羧基末端水解酶30（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 30，USP30），似乎通过从线粒体中去除泛素链来拮抗该途径，直到parkin激活足以超过USP30对泛素链的去除。

阐明决定parkin激活状态的生化机制一直是该研究领域的主要焦点。

PINK1激活parkin的机制
在线粒体健康的细胞中，parkin以自身抑制的形式广泛定位在细胞质中。

然而，在线粒体损伤和PINK1在MOM上稳定后，parkin 可以经历PINK1引发的一系列修饰（包括磷酸化、多种构象变化以及与Ser65磷酸化泛素（Ser65-phosphorylated ubiquitin，pSer65-Ub）的结合），促进其与MOM的稳定结合及其E3泛素连接酶活性的激活。

为了简单起见，分别描述了parkin激活的两个主要步骤——通过parkin-泛素样（parkin ubiquitin-like，UBL）结构域磷酸化的直接激活和通过与pSer65-Ub结合的激活——然后描述了这些事件如何在MOM上协同作用，以产生促进线粒体自噬的前馈泛素化过程。

应该注意的是，在下文描述的许多研究中，实验方法是在模型细胞系统中过表达parkin或PINK1，考虑到反馈回路的参与，这可能具有未知的影响，并且结果可能更难解释。

Figure 2. parkin和pSer65-Ub的结构解剖通过PINK1依赖性UBL磷酸化激活内在的parkin。

泛素系统采用了一系列泛素装载和转移事件，最终导致泛素的C端Gly76残基转移到底物上的赖氨酸残基（初级泛素化），或泛素本身的赖氨酸残基以延伸泛素链。

泛素在ATP存在下被E1
泛素激活酶激活，并转移到几种E2泛素缀合酶之一的活性位点的半胱氨酸残基上以形成硫酯键。

这种E2酶与E3泛素连接酶中的RING finger或HECT结构域相互作用，以促进泛素向底物的转移。

Parkin是RING-between-RING（RBR）E3泛素连接酶；它包含N 末端UBL结构域、结合E2酶的中心RING1结构域、一个in-between RING （IBR）结构域和含有催化半胱氨酸残基的C末端RING2结构域（Figure 2a）。

RBR E3s类似于含有HECT结构域的蛋白质，利用其RING1结构域催化泛素从带电的E2酶转移到RING2中的催化半胱氨酸残基。

与HECT E3s一样，这种泛素硫酯随后被释放到底物赖氨酸残基上（Figure 2a，左图）。

三种机制涉及parkin自动抑制，必须克服它们才能将parkin转化为活性酶（Figure 2a，右图）。

首先，parkin的UBL结构域靠在RING1内的两个核心α螺旋元件之一上，阻断E2的进入（Figure 2b）。

第二，抑制性（repressive，REP）元件与UBL域和RING1二者对接，进一步阻止E2接入（Figure 2b）。

第三，RING2中的催化Cys431残基被位于UBL结构域和RING1之间的独特的parkin结构域（unique parkin domain，UPD；也称为RING0）屏蔽，从而阻断泛素从带电荷的E2转移到parkin的催化半胱氨酸残基（Figure 2b）。

因此，多重构象变化是必要的，以消除这些自动抑制的限制。

自从发现PINK1在parkin上游发挥作用以来，人们一直致力于了解PINK1如何直接调节parkin活性。

一项早期研究发现，
PINK1磷酸化了人SH-SY5Y细胞中的parkin，并且PINK1依赖性磷酸化促进了parkin形成Lys63连接的泛素链的能力。

然而，parkin的磷酸化位点及其激活机制尚未报道。

对parkin激活的关键见解来自于PINK1磷酸化parkin的UBL结构域中的Ser65，并且在Ser65处的parkin磷酸化（pSer65-parkin）促进体外parkin的泛素链组装。

随后的研究使用Ser65化学计量磷酸化的parkin，结合质谱法对泛素链形成的定量测量，表明pSer65-parkin在体外将链组装活性提高了约2400倍。

因此，parkin在其UBL结构域上的磷酸化显著激活了其内在的泛素连接酶活性。

Ser65处的UBL结构域磷酸化破坏了UBL–RING1相互作用，并被认为允许UBL结构域通过其系链移动到UPD （Figure 2b–d）。

有趣的是，UBL结构域的释放是由parkin （Trp403Ala）的突变模拟的，该突变被认为从RING1部分释放REP元件以促进E2的结合（Figure 2b–d）。

该模型与分子动力学模拟一致，分子动力学模拟表明，UBL磷酸化从其与RING1的紧密相互作用中释放出UBL结构域，并导致REP元件构象的微小变化，为带电的E2进入RING1提供了途径。

从parkin 核心释放UBL结构域提供了已知对PINK1磷酸化重要的UBL结构域的疏水性Ile44残基的通路，这在一定程度上解释了在磷酸化之前释放UBL域的需要。

随后的结构改变传播到RING2结构域，如催化Cys431残基的反应性增加所示（BOX 2）。

PINK1磷酸化泛素可促进parkin活化和线粒体保留。

当发现泛素和泛素链是PINK1底物，并且pSer65-Ub链与线粒体上的parkin激活和保留有关时，确定了PINK1对受损线粒体的第二种作用模式。

parkin的UBL结构域在氨基酸序列上与泛素约有30%相同（约50%相似），包括含有Ile44的表面的基本保守性，其接近Ser65（Figure 2e，f）。

重要的是，发现parkin UBL 结构域中的Ser65在泛素中是保守的，这导致PINK1可以直接磷酸化Ser65上的泛素。

线粒体自噬诱导过程中的定量磷酸蛋白质组学、候选PINK1底物的无偏鉴定以及泛素存在下PINK1对parkin的生物化学激活研究也都分别将泛素鉴定为PINK1靶标。

初步的生化研究表明，单体pSer65-Ub不仅与parkin物理结合，而且可以部分激活其泛素链组装活性，而不依赖于parkin上的Ser65磷酸化。

尽管体内parkin似乎以线粒体上泛素链的形式与pSer65-Ub结合（如下所述），但单体pSer65-Ub已成为理解parkin 在MOM上激活和保留的生化和结构基础的有用工具。

pSer65-Ub 可以在体外与未磷酸化的parkin和pSer65-parkin结合，但与pSer65-parkin的结合强度增强约为20倍。

此外，虽然pSer65-Ub 与未磷酸化的parkin的化学计量结合激活链合成约1000倍，但pSer65‐parkin和pSer65−Ub的复合物显示出比未磷酸化parkin 高约4400倍的链合成活性。

最近，对通过纳米体稳定的PINK1-泛素复合物的结构进行分析，深入了解了PINK1如何特异性识别泛素。

PINK1在蛋白激酶中是独特的，因为它的N端叶包含三段氨基酸序列，称为插入，
这是其他蛋白激酶所没有的。

该结构表明，这些插入物通过PINK1中Ser202和Ser204的自动磷酸化而稳定，从而产生嵌合体物3的独特构象，从而能够识别泛素作为底物。

此外，泛素在与PINK1结合时处于独特的C末端收缩构象（泛素-CR），这将其Ser65残基置于PINK1催化中心附近的延伸环中。

泛素-CR构象被认为是pSer65-Ub54所特有的，但最近有报道称，在未修饰的泛素中发现了低丰度的泛素-CR，并与泛素的传统构象快速交换。

缺乏嵌合体3的PINK1的结构最近也被描述。

这些研究解释了PINK1的关键特征，包括为什么PINK1对泛素和parkin-UBL结构域作为底物具有高度选择性，以及在帕金森病患者中发现的PINK1突变中有多少破坏了催化活性或底物识别。

结构和功能研究表明，通过在parkin内实现重要接触，pSer65-Ub促进连接RING1和IBR结构域的中心α螺旋（H3）的形成（Figure 2a，d），从而从parkin核心释放UBL结构域（Figure 2d）。

parkin–pSer65-Ub共复合物中的关键是parkin中的一簇带正电荷的残基（Lys151和His302），它们与pSer65-Ub中的磷酸盐结合，其突变消除了与pSer65-Ub的结合以及pSer65-Ub在体外激活parkin。

pSer65-Ub与UBL结构域连接子缺失59个残基的parkin形式结合的晶体学分析（Figure 2a）导致了涉及parkin 二聚体的活化的替代模型，其中pSer65-Ub结合打开IBR结构域上的表面，然后与带电荷的泛素~E2硫酯的供体泛素相互作用（其中~表示硫酯键），E2本身与相邻的parkin分子的RING1结合。

这一模型得到了以下发现的支持，即IBR残基中被预测与供体泛素直接相互作用的突变在体外减少了parkin的链合成，尽管这些突变体没有在体内进行测试。

对活性全长pSer65-parkin与pSer65-Ub复合物的生物物理分析揭示了单体1:1复合物。

虽然可以想象，在催化过程中，pSer65-parkin二聚体会短暂组装，但pSer65-parkin中的UBL结构域似乎无法促进二聚体的形成，至少在不存在用于生物物理测量的带电UBCH7的情况下是如此。

生物物理和分子动力学测量也表明，缺乏UBL结构域的parkin 与泛素~E2的结合触发了RING2结构域向RING1的大规模扩散运动，从而促进泛素转移到位于RING2中的Cys431。

需要分析处于转移前状态和含有泛素荷电的RING2状态的全长pSer65-parkin –pSer65-Ub–泛素~E2–底物复合物，以确认这些模型中哪一个是正确的。

同样值得注意的是，涉及变构UBL结构域的激活机制已被描述用于其他RBR E3，暗示了RBR E3的激活机制的保守元件。

线粒体表面泛素化
在线粒体损伤的几分钟内，parkin在MOM上被募集和激活，并启动局部底物的泛素化。

许多工作都集中在识别响应线粒体损伤的parkin底物上。

早期研究确定了几种不同功能的靶标，包括线粒体融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）、MFN2、电压依赖性阴
离子选择通道（voltage-dependent anion-selective channel，VDAC）蛋白、线粒体分裂1蛋白（fission 1 protein，FIS1）、线粒体导入受体亚基TOM20同源物（mitochondrial import receptor subunit TOM20 homologue，TOMM20）和CDGSH铁硫结构域含蛋白1（CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 1，CISD1），它们都位于MOM上。

为了鉴定parkin靶点和初级泛素化位点，进行了线粒体去极化后的定量diGLY捕获蛋白质组学。

在许多MOM蛋白的细胞质结构域上以及在响应parkin激活而被募集到线粒体的几种细胞质蛋白上发现了泛素化位点（见下文）。

在过表达parkin的HeLa细胞中，线粒体的泛素化分为两个阶段：初始阶段（前两小时），在此期间主要底物是MOM蛋白的胞质结构域，然后是第二阶段，在此期间，定位在线粒体内的一组蛋白成为泛素化的靶点。

在存在过表达的parkin的情况下，线粒体去极化可导致MOM断裂，从而可能使内膜蛋白暴露于parkin 或其他E3的作用下。

然而，目前尚不清楚MOM断裂是否发生在神经元的内源性parkin水平，以及它是否在线粒体自噬中发挥特定作用。

MOM上parkin底物的多样性和parkin内缺乏明显的底物识别元件表明parkin缺乏固有的底物特异性。

因此，MOM上底物的身份可能不如组装在指定线粒体自噬底物上的泛素链的密度重要。

事实上，如下所述，线粒体自噬受体具有与线粒体上特定类型的泛素链结合的能力。

泛素链可以通过泛素上七个赖氨酸残基
（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）中每一个的ε-氨基以及其N末端甲硫氨酸残基的α-氨基组装，并且链可以是直链、支链或混合的。

不同类型的链连接可以通过特定的泛素结合域（ubiquitin binding domains，UBDs）来区分，例如在线粒体自噬受体中发现的那些。

我们现在知道，在内源性泛素背景下过表达parkin的细胞中，线粒体去极化导致MOM上形成Lys6、Lys11、Lys48和Lys63链连接，并且parkin可以在体外催化这些相同连接的形成，但尚不清楚这些链是如何分布在不同的线粒体底物上的，在每种类型的底物上构建的链有多长，或者可能存在具有混合或支链拓扑结构的链的程度。

虽然与单泛素化相反，多泛素化被认为对线粒体自噬受体的募集至关重要，但单泛素化也可能通过作为PINK1磷酸化的靶标而发挥重要作用。

Figure 3. 线粒体去极化反应中parkin活化的前馈机制
线粒体上parkin活化的模型
上述泛素和parkin磷酸化的机制导致了一种模型，其中线粒体损伤促进了快速的泛素链聚合，这是两种平行作用的机制的结果，这两种机制共同产生了正反馈回路（Figure 3）。

一方面，由于PINK1磷酸化预先存在的泛素分子或由parkin 构建的链，pSer65-Ub在线粒体上的积累通过与pSer65-Ub的直接相互作用促进了胞浆未磷酸化的parkin的募集（Figure 3Ba）。

HeLa细胞中受损线粒体上多达20%的泛素分子在存在催化活性parkin的情况下，在线粒体去极化时以PINK1依赖的方式被磷酸化。

parkin–pSer65-Ub相互作用有两个主要后果：它部分激活parkin的泛素连接酶活性约达1000倍，从而促进MOM上的泛素链组装；并且它大大增加了PINK1磷酸化parkin-UBL结构域的速率。

使用荧光泛素探针获得了类似的结果，这也表明添加线粒体Rho-GTPase（mitochondrial Rho GTPase，MIRO）作为parkin 底物可以进一步提高泛素转移和链聚合的速率。

pSer65-Ub与pSer65-parkin的结合比未磷酸化的parkin强约20倍，因此有利于在受损MOM上保留完全活性的pSer65-Parkin。

此外，由于与pSer65-Ub结合的pSer65-parkin具有最佳活性（约4400倍活化），其在MOM上的保留促进了泛素链的进一步组装，并为PINK1的磷酸化提供了额外的泛素分子，从而产生了前馈机制（Figure 3）。

另一方面，parkin可以被MOM上的PINK1直接磷酸化和激活（独立于其与pSer65-Ub的初始相遇），以局部产生泛素链（Figure 3Bb），泛素链成为PINK1将更多pSer65-parkin募集到MOM的底物，从而用作初始扩增步骤。

泛素链磷酸化在前馈过程中的重要性通过观察到表达不能磷酸化的泛素突变形式（泛素Ser65Ala）的细胞在MOM蛋白上表现出泛素链合成减少、parkin 向MOM的募集显著减少、线粒体自噬率降低而得到强调。

当parkin 在其PINK1磷酸化位点（parkin-Ser65Ala）发生突变时，泛素结合进一步减少，这与parkin最活跃的形式在其UBL结构域上被磷酸化并与pSer65-Ub结合的发现一致。

泛素磷酸化对parkin募集的重要性也通过过表达的Ser65类磷酸化线性四聚泛素链在缺乏PINK1的情况下促进parkin招募的能力得以证明。

对前馈回路有贡献的两种机制的相对重要性尚不清楚。

不能结合pSer65-Ub的Parkin突变体未能被募集到线粒体并促进泛素链组装，尽管在被UBL结构域磷酸化激活时仍保持催化活性。

这一发现表明，募集和完全的parkin激活需要PINK1磷酸化线粒体上预先存在的泛素（Figure 3）。

然而，催化缺陷的parkin-Cys431Ser突变体不能被检测到募集到去极化的线粒体中，这表明parkin的泛素链合成对于足够的pSer65-Ub在线粒体上积累并将parkin募集到可检测的水平是必要的，至少在所使用的HeLa细胞模型系统中是如此。

虽然很明显，parkin与pSer65-Ub 的结合加速了其UBL结构域的PINK1依赖性磷酸化，但在线粒体。