萝卜SCPL3_基因的克隆与生物信息学分析

李紫薇，霍燕琦，徐铭婕，等.萝卜SCPL3基因的克隆与生物信息学分析［J ］.中南农业科技，2023，44（10）：13-16．
丝氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases ，SCP ）是一类真核生物水解酶，主要存在于真菌或植物的液泡以及动物的溶酶体中［1］。

丝氨酸羧肽酶类蛋白（Serine carboxypeptidase-like proteins ，SCPL ）是与SCP 在结构和功能上高度相似的一类蛋白，二者同属于SC 族羧肽酶中的S10蛋白家族［2］。

S10蛋白家族是催化功能蛋白成熟的庞大蛋白水解酶家族，可分为溶酶体Pro-Xaa 羧肽酶、丝氨酸D-Ala-D-Ala 羧肽酶、羧肽酶C 、羧肽酶D 四大类酶，植物中的
SCP/SCPL 蛋白基本都属于羧肽酶C 和羧肽酶D ［3］。

根据氨基酸序列特征，SCP/SCPL 蛋白可分为羧肽酶Ⅰ、羧肽酶Ⅱ、羧肽酶Ⅲ三大类［4］，动植物中的SCPL 蛋白多属于羧肽酶Ⅰ和羧肽酶Ⅱ，而羧肽酶Ⅲ主要存
在于植物、酵母和丝状真菌中［5］。

此外，有些SCPLs 除
了具有肽酶活性外，还具有酰基转移酶活性［6］。

结构上，SCP/SCPL 蛋白均含有高度保守的“α/β水解酶折叠”三级结构以及独特的拓扑结构催化中心［7］，存在1个与底物结合的保守结构域和3个催化作用的保守结构域，含有多个N-糖基化位点，1个细胞内分泌和转运信号肽［5］。

功能上，SCP/SCPL 蛋白参与调控植物多种生理过程，主要涉及种子萌发过程中储存蛋白的水解反应［8］、植物创伤应答反应［9］、油菜素内酯信号转导途径［10］、细胞程序性死亡时胞内组分的自溶［11］、植物次生代谢物的酰基化修饰及对逆境的响应［12］。

萝卜（Raphanus sativus L .）为一年或二年生十字花科草本植物，是世界重要的蔬菜作物，具有较高的经济、药用和食用等价值。

但在萝卜的生长发育过程中经常遭受多种生物和非生物胁迫，严重影响其产量与品质。

发掘萝卜抗逆性相关基因，不仅能揭示其抗性分子机制，也能加快萝卜抗性育种进程。

SCPL 蛋白在调控高等植物的多种生理过程中发挥重要作用，但萝卜SCPL 基因的功能和表达调控研究鲜见报道。

本研究通过RT-PCR 技术克隆了萝卜SCPL3（RsSCPL3）基因CDS 全长序列，并对其进行生物信息学分析，旨在为进一步开展该基因的功能研究提供参考。

1
材料与方法
1.1
试验材料1.1.1供试材料
心里美萝卜高代自交系
CCHX17-6。

1.1.2
供试试剂RNA 提取试剂盒FastPure Univer⁃
sal Plant Total RNA Isolation Kit 、DL2000Plus DNA Marker （南京诺唯赞生物科技股份有限公司），反转
录试剂盒PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit （北京宝日医生物技术有限公司），KOD-Plus-Neo 高保真酶［东洋纺（上海）生物技术有限公司］，pENTR ™/D-TOPO ®cloning kit （Invitrogen ），琼脂糖凝胶
DNA 回收试剂盒（天根生化科技有限公司），琼脂
收稿日期：2023-03-06
基金项目：国家级大学生创新训练计划项目（202213573030Z ）；金陵科技学院科研孵化项目（jit-fhxm-202113）
作者简介：李紫薇（2002-），女，湖南郴州人，在读本科生，（电话）155****2212（电子信箱）****************；通信作者，刘同金（1985-），男，
讲师，博士，主要从事蔬菜种质资源与分子生物学研究工作，（电话）181****2512（电子信箱）******************.cn 。

萝卜SCPL3基因的克隆与生物信息学分析
李紫薇，霍燕琦，徐铭婕，张文静，刘同金
（金陵科技学院园艺园林学院，南京
210000）
摘要：采用RT-PCR 技术克隆了萝卜（Raphanus sativus L .）SCPL3基因CDS 序列，并对其进行生物信息学分析。

结果表明，萝卜SCPL3基因CDS 序列全长1434bp ，编码477个氨基酸，分子式为C 2493H 3762N 632O 709S 21，相对分子质量为54.6kD ，理论等电点为6.33，脂肪系数为81.30，不稳定系数为39.26，平均亲水值为-0.227，是稳定亲水蛋白；亚细胞定位预测该蛋白最有可能定位于液泡，存在1个信号肽和3个跨膜结构，含有SC 族羧肽酶中的S10蛋白家族结构域；系统进化分析表明其与十字花科作物SCPL 蛋白同源性较高。

关键词：萝卜（Raphanus sativus L .）；SCPL3基因；克隆；生物信息学中图分类号：Q785
文献标识码：A
文章编号：2097-2083（2023）10-0013-04
中南农业科技2023年
糖、50×TAE缓冲液、硫酸卡那霉素、琼脂粉、LB培养基［生工生物工程（上海）股份有限公司］，GelRed核酸染料（Biosharp），DH5α大肠杆菌化学感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司）。

1.1.3主要仪器MIKRO220R型高速冷冻离心机（德国Hettich公司），S1000TM型PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司），DYY-2C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司），GenoSens1880型凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司），DW-86L286型超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司产品），SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州净化设备有限公司），HVA-85型高压灭菌锅（日本HIRAYAMA公司）。

1.2试验方法
1.2.1RNA提取及cDNA合成将萝卜自交系CCHX17-6种植于金陵科技学院园艺实验站，取成熟期肉质根于液氮中速冻，于-80℃冰箱中保存备用。

利用RNA提取试剂盒从萝卜肉质根中提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，利用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2引物设计与PCR扩增根据已发表的萝卜基因组数据［13］，设计并合成RsSCPL3基因的特异性引物SCPL-F：（5′-caccATGGCTAAGAAGTTGCTTC TGCTTC-3′）和SCPL-R：（5′-TTAGAGAGGTTGAC⁃CACTAATCCACCTC-3′）。

以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL，其中cDNA模板3μL，10×PCR Buffer5μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，25mmol/L MgSO43μL，2mmol/L dNTPs5μL，酶（1U）1μL，ddH2O30μL；PCR扩增程序使用两步法：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃延伸1min，35个循环。

1.2.3目的片段的回收、载体构建与测序将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒进行目的条带的切胶回收，将回收产物连接到pEN⁃TER-TOPO载体上，重组产物转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌液PCR筛选阳性进行克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4生物信息学分析利用ExPASy-ProtParam tool（http：///protparam/）进行RsSCPL3蛋白质的理化性质分析；利用ExPASy-ProtScale （http：///protscale/）预测蛋白亲疏水性；利用Signalp4.1（https：//services.healthtech.dtu. dk/service.php？SignalP-4.1）分析信号肽；利用TMHMM2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/ser⁃vice.php？TMHMM-2.0）预测跨膜结构域；利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测；利用NCBI-CDS（https：/// Structure/cdd/wrpsb.cgi/）预测保守结构域；利用SPO⁃MA（http：//www.ibcp.fr/predict.html/）预测蛋白质二级结构；运用MEGA软件构建RsSCPL3蛋白系统进化树（Neighbor-joining法，Bootstrap值设置为1000）。

2结果与分析
2.1RsSCPL3基因克隆
以萝卜肉质根的cDNA为模板，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳获得了1500bp左右的目的片段（图1）。

测序结果表明，RsSCPL3基因CDS序列大小为1434bp，编码477个氨基酸。

2000bp
1500bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
1M
1.目的条带；M.DL2000Plus DNA Marker
图1RsSCPL3基因克隆
2.2RsSCPL3蛋白理化性质的分析
预测RsSCPL3蛋白分子式为C2493H3762N632O709S21，相对分子质量为54.6kD，原子总数为7617，理论等电点（PI）为6.33。

RsSCPL3蛋白带负电荷残基（Asp+Glu）为49，正电荷电残基（Arg+Lys）为45，脂肪系数为81.30，不稳定系数为39.26，属于稳定蛋白。

ProtScale预测RsSCPL3蛋白平均亲水值为-0.227，且第9位和第10位的亮氨酸（Leu）表现最大疏水性，疏水均值为3.956，第63位的天冬酰胺（Asn）表现最大亲水性，分值为-3.122，说明其为亲水性蛋白。

2.3RsSCPL3蛋白信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位
信号肽主要功能为促进蛋白质连续进入分泌途径并将蛋白质运送至细胞外，本研究利用Signalp 4.1预测RsSCPL3蛋白具有1个信号肽（图2）。

TMHMM2.0预测该蛋白存在3个跨膜区域（图3），WoLF PSORT预测其最有可能定位于液泡中，在细胞外基质和内质网膜上也可能有分布，表明其可能为分泌蛋白。

14
第10期1.0
0.80.60.40.20得分0
50100150200250300350400450500
氨基酸位置
C-score
S-score Y-score
图2
RsSCPL3蛋白信号肽预测
1.21.00.80.60.40.20
概率50100150200250300350400450
序列位置
跨膜区膜内区膜外区
图3RsSCPL3蛋白跨膜结构域预测
2.4RsSCPL3蛋白保守结构域和二级结构预测使用NCBI 的Conserved Domains 工具，预测发
现RsSCPL3蛋白具有1个属于SC 族羧肽酶中的S10蛋白家族的保守结构域（图4）。

SPOMA 预测RsSCPL3蛋白二级结构，发现该蛋
白由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成，其分别包含147、34、89和207个氨基酸，占比分别为30.82％、7.13％、18.66％和43.40％（图5）。

序列位置特异位点非特异位点
超家族
50
100
150
200250
300
350400450477
Peptidase_S10PLN02209
Peptidase_S10superfamily
Kex1
Carbpep_Y_N superfamily
图4RsSCPL3的保守结构域预测
50100150
200250300
350400450
序列位置
50
100
150
200250300
350
400450
序列位置
Helix Sheet Tum Coil
图5RsSCPL3蛋白二级结构预测
2.5RsSCPL3蛋白系统进化树
为明确RsSCPL3与其他植物的系统进化关系，
利用MEGA 软件构建系统进化树。

结果表明，RsSC⁃PL3蛋白与甘蓝型油菜（Brassica napus ）、甘蓝（Bras⁃sica oleracea ）、芝麻菜（Eruca vesicaria subsp.sativa ）、
菥蓂（Thlaspi arvense ）、盐芥（Eutrema salsugineum ）等十字花科植物同源蛋白聚为一类，亲缘关系较近，而与苦瓜（Momordica charantia ）、甜橙（Citrus sinensis ）、大豆（Glycine max ）、茶（Camellia sinensis ）、曼陀罗（Datura stramonium ）等亲缘关系相对较远（图6）。

图6RsSCPL3与其他植物同源蛋白的系统进化树分析
XP 033136677.1白菜Brassica rapa
NP 850034.1拟南芥Arabidopsis thaliana XP 006404766.1盐芥Eutrema salsugineum CAH2054202.1菥蓂Thlaspi arvense
CAH8352158.1芝麻菜Eruca vesicaria subsp.sativa VDD52862.1甘蓝Brassica oleracea
XP 013649830.2甘蓝型油菜Brassica napus ●RsSCPL3
KFK44962.1高山南芥Arabis alpina XP 010461188.1亚麻芥Cameline sativa XP 022159416.1苦瓜Momordica charantia KAH9689978.1甜橙Citrus sinensis KAH1244529.1大豆Glycine max XP 028052162.1茶Camellia sinensis
MCE3050083.1曼陀罗Datura stramonium
0.05
100
100
10088
50
56
100100
93
82
47
39
3讨论
SCP /SCPL 基因参与调控植物的多种生理过程。

拟南芥（Arabidopsis thaliana ）BRI1在油菜素内酯信号转导中发挥作用［14］。

通过表达AtECS1可增加油菜植株的心皮数、荚果种子数以及千粒重，且ECS1
李紫薇等：萝卜SCPL3基因的克隆与生物信息学分析
15
中南农业科技2023年
也可能参与油菜素内酯信号的转导过程［15］。

水稻（Oryza sativa L.）GS5基因调控谷粒大小，在提高水稻产量方面具有重要意义［16］。

烟草（Nicotiana taba⁃cum）NtSCP1和NtSCP2基因参与调控细胞生长［17］，在植株形态发育方面起作用。

豌豆（Pisum sativum）PsCP基因在种子生长发育中起重要作用［18］。

此外，SCP/SCPL基因在植物对生物和非生物胁迫的响应过程中也发挥重要作用。

水稻OsBISCPL1能被BTH、JA、SA、ACC等抗病信号分子诱导表达，并且在水稻和稻瘟病菌的非亲和性互作中上调表达［10］。

干旱、盐、ABA、MeJA和BR诱导小麦TaSC⁃PL184-6D显著上调表达［19］。

玉米（Zea mays）Zm⁃SCP响应立枯丝核菌胁迫，且ABA、JA、高盐和低温处理均诱导其上调表达［20］。

赤霉素诱导豌豆PsCP 基因上调表达，而多效唑抑制其表达［18］。

黄瓜（Cu⁃cumis sativus L.）中多个SCPL基因响应盐胁迫和白粉病菌侵染［21］。

4小结
本研究从心里美萝卜中克隆出SCPL3基因并对其进行系统的生物信息学分析，其分子式为C2493H3762N632O709S21，是稳定亲水性分泌蛋白，含有SC族羧肽酶中的S10蛋白家族结构域，可能定位于
液泡，存在1个信号肽和3个跨膜结构域，与甘蓝型油菜、芝麻菜等十字花科植物同源性较高。

研究结果为下一步RsSCPL3基因的功能和表达调控机制研究奠定了基础。

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