香菇135菌株特异SCAR标记的分布和遗传特性

香菇135菌株特异ＳＣＡＲ标记的分布和遗传特性
摘要：用香菇(Lentinula edodes)135菌株的特异SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)引物135F/R（扩增601bp的条带）对135菌株的58个原生质体单核体和97个孢子单核体的基因组DNA进行扩增，检验此特异标记在单核体中的分布和遗传规律。

原生质体单核体分为两种交配型A1B1和A2B2，此标记仅存在于后一种核中；另外，此标记在四种交配型的孢子单核体后代中随机分布，显示这个SCAR标记可以稳定遗传到后代，而且与交配型A、B因子之间没有连锁关系。

关键词：遗传规律；香菇；交配型；特异SCAR标记
香菇(L. edodes)具有很高的食药用价值，在我国的栽培面积很广，世界年产量居第二位。

尽管它的经济价值如此重要，但我们仍然没有标准的菌株鉴定方法，假种错种问题直接导致农民经济损失，育种进程受阻，制约了我国香菇产业的发展。

所以，快速准确的鉴定香菇菌种是当前研究的重点。

近年来，已有很多SCAR标记被应用于香菇菌株的鉴定。

其中135菌株的一个SCAR特异标记的建立已在生产实践中应用并取得了良好的效果［1］。

135菌株的子实体菇体结实，菇盖圆整，质量好且容易形成花菇，因而在国内广受好评，栽培面积很广。

虽然135菌株特异SCAR标记的可行性和可信度已经得到证实，但是这个标记在135菌株的两个核中是否均匀分布，在有性繁殖过程中是否能够稳定遗传还需要进一步探索。

本实验中，我们利用135菌株的58个原生质体单核体和97个孢子单核体对此标记的特性进行了研究，现将结果报告如下。

1 材料和方法
1.1菌株来源
135菌株（庆元135）由上海农科院食用菌研究所菌种保藏中心提供。

1.2原生质体的制备
以135菌株为材料制备原生质体［1,2］。

将菌丝接种在PDA平板上活化约10 d后，将表面菌丝刮下，置于均质仪中，加入约50 mL的PD液体培养基，高低速间隔打碎约30 s，分别倾倒在两个盛有25 mL PD培养基的三角瓶中，每瓶约倒20 mL，25 ℃静置培养。

菌丝培养3~5 d后，用无纺布过滤，经无菌水冲洗，用灭菌吸水纸吸干水分。

用0.6 mol/L的甘露醇配制1.5%的溶壁酶溶液6 mL，经孔径为0.45 μm的细菌过
滤器过滤除菌后，将1 g左右菌丝转移到盛有酶液的10 mL离心管中，使其均匀散开，35 ℃酶解3 h，间或摇晃，使菌丝与酶液充分接触。

酶解结束后，用带有棉塞的注射器过滤除去残留菌丝，3000 r/min(1000×g)离心10 min，倾去上清液，原生质体沉淀用0.6 mol/L的甘露醇洗涤1~2次后用血球计数板镜检计数，将悬液稀释到最佳浓度，梯度涂布于再生培养基PDMS 平板上，25 ℃恒温培养6~7 d后可见星芒状再生菌落。

挑每日出现的较小菌落转移到PDA平板中，培养约7 d后，挑菌落边缘菌丝镜检，无锁状联合的为所需单核体材料，编号保藏备用［2］。

1.3原生质体交配型鉴定
从得到的原生质体单核菌株中任选一个Pa作为标准菌株，交配型定为A1B1，将其与其余所有单核配对培养，两接种块之间距离0.5 cm，25 ℃培养，直到两单核菌落接触，挑取菌落接触区两边菌丝进行镜检，有锁状联合的即为与标准菌株交配型不同的A2B2，无锁状联合的为A1B1［2］。

张美彦，等：香菇135菌株特异SCAR标记的分布和遗传特性
1.4孢子单核体的制备
将菌株135的新鲜子实体菌褶向下放置于灭菌平板中，24 h后平板内会出现孢子印，将平板封存。

从封存的平板中挑取少许孢子于无菌水中，充分混匀后，用血球板计数器镜检计数，系列稀释至10.4 个/mL左右，吸取100 μL孢子悬液于PDA培养基平板上并涂布均匀，25 ℃培养3 d后观察，将出现的白点转到新的PDA平板上，到菌落长到直径0.5㎝以上时，在菌落边缘挑取少量菌丝镜检，无锁状联合的即确定为单核体菌丝，编号保存备用［3］。

1.5孢子单核体交配型鉴定
首先选取一个与交配型为A1B1的原生质体单核体亲合的孢子单核体Sa做为测试菌株，指定其交配型为A2B2，将其与其余所有单核体进行配对培养，两接种块之间距离0.5~1 cm，25 ℃培养2~4周后，挑取菌落接触区两边菌丝进行镜检，有锁状联合的即为与Sa交配型的A、B均不相同的第一组单核，其交配型为A1B1。

在第一组的单核中任意选取一株Sb，分别与第一轮交配中不与Sa 亲合的单核配对培养，发生亲合反应的即为与Sa交配型相同的第二组单核体，其交配型为A2B2。

至此，在与前两组均不亲合的单核体中任选一株Sc，与其余所有在前两轮中不亲合的单核体进行配对培养，发生亲合反应的即为与Sc菌株A、B均不相同的第三组单核，再从第三组中任选一株与所有在第三轮交配中不亲合的单核体配对培养，发生亲合反应的为第四组单核。

重组型的交配型由配对时菌落形态的栅栏反应鉴定，出现栅栏反应为A因子不同B因子相同。

另外将四种标准交配型的单核体分别与所有单核配对培养，确定是否出现与一种以上标准交配型亲合的单核体，即确定是否有与四种正常出现的标准交配型不同的新的A因子和B因子的类型［4］。

1.6基因组DNA的提取
将菌丝从25 ℃培养了约15 d的PDYA培养基表面刮下，基因组DNA的提取参照LETS方法［5］并加以改进。

菌丝经过裂解以后，上清液分别用酚∶氯仿（1∶1）以及氯仿∶异戊醇（24∶1）进行两次抽提，乙醇沉淀后用70%的乙醇洗两次，沉淀融于45 μL TE缓冲液中，加入1 μL RNase (10 mg/mL)，37 ℃温育1 h。

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7SCAR分析
PCR体系中加入了ITS通用引物以保证模板的质量，排除假阴性［6］。

25 μL 反应体系中包括2.5 μL反应缓冲液，2.0 mM MgCl 2, 120 μM dNTP, 0.4 μM SCAR primers, 0.12 μM ITS1 and ITS4, 1.0 U Taq酶, 1.0 μL(~25 ng)模板以及16.8 μL ddH 2O。

反应条件如下：预变性94 ℃3 min; 94 ℃1 min, 61 ℃1 min，72 ℃1 min（35个循环），补平72 ℃5 min. PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(150 V,1×TAE缓冲液, 约45 min)，EB染色后，用VDS摄影系统（Pharmacia Biotech）观察并记录结果。

统计特异SCAR条带的有无。

1.8X.2测验
依据文献［7］进行X.2测验，X.2=∑(O-E).2E，其中O为每种交配型数量实测值，E为该种交配型数量的理论值，按其自由度查表，分析各种交配型菌株的分布是否符合1∶1∶1∶1的分离规律。

2 结果与分析
2.1135菌株原生质体单核体的交配型
以135菌株为材料制备原生质体得到58个单核体，其中交配型为A1B1的单核有25株，A2B2的单核有33株，两种交配型的单核在菌落形态上有明显差异，交配型为A1B1的单核体气生菌丝少，形态疏松，长势相对弱，而交配型为A2B2的单核体气生菌丝旺盛，颜色浓白（图1）。

左图为交配型A1B1的单核体菌落形态，右图为交配型为A2B2的单核体菌落形态
Left: A1B1 mating type, Right: A2B2 mating type
图1 两种不同交配型单核体的形态
Fig. 1 Phenotypes of the different mating type protoplast monokaryons
2.2135菌株孢子单核体的交配型
以135菌株为材料分离得到294个孢子单核体，经过交配反应后，将所有单核体按照交配型分为10组，各组之间没有明显的菌落形态区别。

四种正常交配型(A1B1、A2B2、A1B2和A2B1)的单核体株数分别为58、71、78、62，占到总数的91.5%。

从整体来看，孢子单核体中四种标准交配型的分布比较均匀，由得到的数据进行卡方独立性分析，得出的卡方值为0.0004，即269个单核中四种标准交配型的分布与理论值1∶1∶1∶1相符，遵守孟德尔独立分离定律，也就是说，A因子和B因子处于不同的连锁群上，这与之前的报道是相符的。

孢子单核体中出现了14个，占总数4.7%的重组交配因子类型，其中3个是A因子发生重组，8个是B因子发生重组，3个在A位点和B位点同时发生重组，证实了交配因子内部基因重组的事实。

而且，B因子出现重组的几率明显比A 因子大，说明B因子内的基因交换几率较大，推断B因子内基因之间的遗传距离可能相对远一些。

另外，表1中第10组孢子单核体与交配型为A1B1、A2B2、A1B2和A2B1的单核体均不能亲合，可能是因为这组单核体的交配因子发生了基因重组，导致了交配功能丧失。

表1 孢子交配型鉴定结果
Table 1 Mating types of the spore monokaryons
交配型Mating type组1（A1B1）Type 1组2（A2B2）Type 2组3（A1B2）Type 3组4（A2B1）Type 4总计Total
单核数Number58（19.7%）71(24.2%)78(26.5%)62(21.1%)269(91.5%)
交配型Mating type组5(A1Br)Type 5组6(A2Br)Type 6组7（ArB1）Type 7组8(ArB2)Type 8组9(ArBr)Type 9组10Type10总计Total
单核数Number2(0.7%)6(2%)1（0.3%）2(0.7%)3(1%)11(3.7%)25(8.5%)
r为重组类型r = recombinants
2.3特异SCAR标记在原生质体单核体和孢子单核体中的分布
实验发现，所有交配型为A2B2的原生质体单核体中都携带有此135特异的标记，而所有交配型为A1B1的原生质体单核体中都不带有此标记。

也就是说，在135双核菌株中只有交配型为A2B2的核携带这个特异SCAR标记。

孢子单核体并未全部提取DNA，仅在菌丝培养过程中随机选用生长比较快、
菌丝积累量大的97个单核体中提取DNA进行SCAR扩增，从表2可以看出，54%的孢子单核体携带有特异标记。

这97个单核体中，四种交配型所占比例相当，而特异标记在四种交配型的单核体中分布均匀。

表2 孢子单核体中标记分布情况
Table 2Distribution of SCAR marker among spore monokaryons
交配型Mating type单核数Number带标记单核数With SCAR marker (%)不带标记单核数Without SCARmarker (%)
A1B12915 (52)14 (48)
A2B22515 (60)10 (40)
A1B22212 (55)10 (45)
A2B12110 (48)11 (52)
总计Total97 52（54）45（46）
从表中可以看出，标记的分布是没有固定规律的，经卡方测验后，标记与A 因子的独立关系测验结果卡方值为0.001，标记与B因子的独立关系测验结果卡方值为0.0005，所以此特异SCAR标记与交配因子A和B都是独立分离关系，存在于与交配因子不同的连锁群上，因此这个标记可以为以后香菇基因组连锁群分析研究提供参照。

M为Marker；P为原生质体单核体；S为孢子单核体；NC为阴性对照，体系中模板为无菌双蒸水；图中上方750bp左右的条
带为ITS扩增产物；下方601bp的条带为135菌株特异的SCAR条带
M: Marker; P: protoplast monokaryon; S: spore monokaryon; NC: Negative control; 750bp band：ITS; 601bp band：SCAR
图2 135特异标记在部分单核体中的分布情况
Fig.2 Distribution of the SCAR marker among a selected number of monokaryons
3 结论与讨论
食用菌传统的表型鉴定易受环境因素影响，且难以区分种内不同的菌株。

而分子标记比较容易获得，不受环境因素以及生育周期的影响，所以近年来分子标
记技术应用的比较多。

其中SCAR标记有稳定，数据易处理等特点［8］。

宋春艳等得到了香菇主栽品种135的特异SCAR标记，并且在实际应用中为菌种管理和指导菇农正确使用菌种提供了技术支持。

我们的数据显示，此135特异SCAR标记仅存在于一种交配型的原生质体单核体中，后续实验也表明携带标记的单核做亲本进行杂交得到的后代都携带有此标记(结果待发表)，也就是说，这个标记可以有效的应用于以此核为亲本的杂交后代的鉴定工作。

原生质体单核体由菌丝制备而来，作为无性后代，两个核完好的保持了各自的性状［9,10］，因而SCAR带的存在也较为规律，仅存在于香菇135的一种核中，这在标记育种的应用上有重要意义。

根据我们的数据，135菌株的特异SCAR标记可以稳定遗传，而且与交配型A和B因子均无连锁关系，这不仅可以用于鉴定杂交产生的后代菌株，而且可以为香菇染色体连锁群的研究提供参考和材料。

致谢：感谢John Buswell 教授对本文英文版进行文字修改。

参考文献
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注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。