酵母双杂交

酵母双杂交
酵母双杂交（筛库）
pGBK-gene 转化酵母
1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测
定OD600，直至OD600达到0.5左右。

4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装
在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm
离心5min。

5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。

7. 弃上清，重
悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前
沸水煮
2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。

9. 加入280μl
PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。

10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。

11. 室温下6000-8000rpm离心20~30s，去上清。

12. 重悬于500μl无菌水中，取100-200μl涂在SD-trp板上，30°C烘箱培养48-72h。

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1. 挑取上述SD-trp板上的pGBK连的基因转化子，YPDA培养基中培养至饱和。

2.
将上述转化子转接至200mlYPDA培养基中，30°C培养至OD600 0.5-0.6左右。

3. 离心
收集菌体，20ml无菌水洗涤，3000rpm离心5min。

4. 去上清，重悬于20ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。

5. 去上清，合
并菌体于一管，1ml TE/LiAc溶液悬浮菌体。

6. 加入鲑鱼精DNA200μl, 20μl AD文库DNA（4μg左右），混匀后，再加入7ml PEG/LiAc
溶液，Vortex，分装，500μl/管。

7. 30°C放置（可用水浴锅30min）烘箱45min以上。

8. 42°C热激30min，30°C 复苏15min。

9. 8000rpm离心5min，收集菌体，各加200μl无菌水混匀后取100μl涂板，SD-His-Trp-Leu，
SD-His-Trp-Leu-Ade平板，30 °C培养。

Note：若要做两个已知蛋白的互作，则只需一步，将pGBK连的基因DNA和pGAD连的基因DNA一起转入酵母即可。

感谢您的阅读，祝您生活愉快。