第八章--发酵染菌及其防治全文编辑修改
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2、发酵染菌的异常现象
(1)菌体浓度异常 菌体浓度异常下降 菌体浓度异常升高 菌体繁殖和代谢速率缓慢
(2)pH过高或过低 pH上升(感染噬菌体,导致菌体自溶,释放大量氨、 氮) pH下降(感染杂菌,基质大量消耗产生酸性物质)
(3)溶解氧及CO2水平异常 溶解氧短时间内下降,甚至接近零,且长时间不能 回升(污染耗氧微生物) 耗氧量减少,溶解氧升高(污染非耗氧微生物或者 噬菌体) 耗糖量加快,CO2含量增加(污染杂菌) 耗糖量减少,CO2含量减少(污染噬菌体)
第一节 染菌对发酵的影响
一、染菌对发酵过程的影响
生产不同的品种,可污染不同种类和性质的微生物。 不同污染时间,不同污染途径,污染不同菌量,不同培 养基和培养条件又可产生不同后果
1、发酵染菌对不同发酵品种的影响
(1)不同生产菌可能污染的染菌 ➢放线菌由于生长的最适pH为7左右,因此染细菌为多 ➢霉菌生长pH为5左右,因此染酵母菌为多。
酚红肉汤培养基检测(检查培养基和无菌空气是否染菌, 肉汤由红变黄) 平板划线 显微镜观察
3、检查的工序和时间
工序 斜面 摇瓶种子 种子罐种子 种子罐种子 种子罐种子 种子罐种子 发酵 发酵 发酵 发酵 发酵 总过滤器 分过滤器
表1 发酵过程的杂菌检查
时间
0h 0h 培养中期 成熟种子 0h 0h 8h 16h 24h 每月一次 每月一次
第八章 发酵染菌及其防治
发酵染菌(contamination):发酵培养过程中除了生产菌 以外,侵入了有碍生产的其它微生物。
发酵染菌的危害 ➢发酵过程污染杂菌,会严重的影响生产,是发酵工业的致 命伤。 ➢造成大量原材料的浪费,在经济上造成巨大损失 ➢扰乱生产秩序,破坏生产计划。 ➢遇到连续染菌,特别在找不到染菌原因往往会影响人们的 情绪和生产积极性。 ➢影响产品外观及内在质量
(1)污染噬菌体的危害 噬菌体的感染力很强,传播蔓延迅速,较难防治,
故危害极大。污染噬菌体后,可使发酵产量大幅 度下降,严重的造成断种,被迫停产。
(2)污染其它杂菌的危害 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫,即使
添加消泡剂也无法控制逃液,影响发酵过程的通气搅 拌。
有的杂菌会使发酵液发臭、发酸,致使pH下降, 使不耐酸的产品破坏(如红霉素失活)。特别是染芽 孢杆菌,由于芽孢耐热,不易杀死,往往一次染菌后 会反复染菌。
第二节 发酵染菌的原因分析
一、发酵染菌率计算基准 总染菌率指一年发酵染菌的批(次)数与总投料
批(次)数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后 培养基经重新灭菌,又再次染菌的批次数在内。这是 习惯的计算方法,也是我国的统一计算方法。
总染菌率%=
二、染菌原因
造成染菌的因素很多,但总结几十年的经验,对绝 大部分罐批染菌的原因是比较清楚的,但在实际生产中 发酵染菌率仍比较高,可以说产生这种现象大多数是由 于工作中“明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理”所 造成的。例如,灭菌的蒸汽压不足不能灭菌;设备有渗 漏不能进罐等等都是众所周知的,但因为有侥幸心理还 是照样灭菌,进罐,结果以污染杂菌而告终。现将我们 收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下:
被检物名称 成熟斜面,抽检 成熟培养基 灭菌后,接种前 接种后发酵液 发酵液 发酵液 灭菌后、接种前发酵液 接种后发酵液 发酵液 发酵液 发酵液 无菌空气 无菌空气
检查方法 平板划线 平板划线及镜检 平板划线 平板划线 平板划线及镜检 平板划线及镜检 平板划线 平板划线 平板划线及镜检 平板划线及镜检 平板划线及镜检 肉汤 肉汤
(4)泡沫过多 污染噬菌体
(5)代谢异常 碳源、氮源消耗异常加快,产物合成速度下降(污 染杂菌) 碳源、氮源消耗下降,甚至不消耗,产物合成速度 大大下降(污染噬菌体)。
第四节 发酵无菌状况的检测和染菌途径的分析
一、发酵无菌状况检测
1、环境无菌的检查 尘埃粒子检测 无菌平板检测
2、种子及发酵液无菌状况检测
原材料储存和保管,如液胨、玉米浆、母液糖等有 机原料——杂菌的数量 发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量——有无 灭菌的死角 对减少或避免染菌仍然是十分必要的。
5、技术管理不善
技术管理就是要对发酵每个环节严格控制,发酵中稍 有不慎就可能染菌,所以不能有侥幸心理而放松管理
第三节 发酵染菌后的异常现象
3、不菌检测方法确证污 染的时间,不是杂菌侵入培养液的时间。
杂菌进入培养液后,需有足够的生长、繁殖的时间才 能显现出来,显现的时间又与污染菌量有关。污染的 菌量多,显现染菌所需的时间就短,污染菌量少,显 现染菌的时间就长。
(1)种子培养期染菌
种子制备是发酵生产的关键,种子培养期指生产菌生长、 繁殖阶段。
➢灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌,对 细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
➢疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养,这是一 类不加提纯而直接使用的产品,在其深层培养过程中,一 旦污染杂菌,不论死菌、活菌或内外毒素,都应全部废弃。 因此,发酵罐容积越大,污染杂菌后的损失也越大。
2、污染不同种类和性质的微生物对发酵的影响
2、发酵染菌对提炼的影响
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其 它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺,则极易发生乳化,很难 使水相和溶剂相分离,影响进一步提纯。 ➢采用不经过滤,直接用离子交换树脂的提取工艺,如链 霉素、庆大霉素,染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂 表面,或被离子交换树脂吸附,大大降低离子交换树脂 的交换容量,而且有的杂菌很难用水冲洗干净,洗脱时 与产物一起进入洗脱液,影响进一步提纯。
➢种子染菌,造成发酵罐染菌,给生产造成巨大损失。 ➢种子培养基营养丰富,容易染菌。 ➢种子接种量较小,生产菌生长开始不占优势,而且培养液 中几乎没有抗生素(产物)或只有很少抗生素(产物)。因 而防御杂菌能力低,容易污染杂菌。 ➢种子培养阶段染菌,应将培养液采取灭菌措施后全部废弃。
(2)发酵前期染菌
➢染菌的发酵液一般发粘,菌体大多数自溶,所以在发酵液 过滤时不能或很难形成滤饼,导致过滤困难。即使采取加热、 冷却、添加助滤剂等措施,使部分蛋白质凝聚,但效果并不 理想。
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异,如污染霉菌时, 影响较小,而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难,过滤时 间拉长,影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用,破坏了生 产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率, 直接影响提炼总收率。
3、种子带菌
种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染 菌。是发酵前期染菌的原因之一。
加强种子管理,严格无菌操作,种子本身带菌是可 以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素 造成。
4、灭菌不彻底
灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 蒸汽通入培养基,升温快慢、保温时间——产生过多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂 在卡那霉素生产中,于炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培 养基采样培养,可发现无法计数的大量的芽孢杆菌;而在冬季 取样的培养中,则仅发现2~3个芽孢杆菌。故染菌率因季节不 同而发生明显变化。
百分率% 25.8 25.8 19.35 19.35 6.45 3.25
第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析
项目 外界带入杂菌(取样、补料) 设备穿孔 空气系统有菌 停电罐压跌零 接种 蒸汽压力不足或蒸汽量不足 管理问题 操作违反规程 种子带菌 原因不明
百分率% 8.20 7.60 26.00 1.60 11.00 0.60 7.80 1.60 0.60 35.00
概念:由于发酵染菌导致发酵过程中的某些物理参数、 化学参数或生物参数发生于原有规律不同的改变。
1、种子培养染菌的异常现象
(1)菌体浓度异常 菌体浓度逐渐降低(一般是感染噬菌体) 菌体浓度迅速增加(大多是感染杂菌)
(2)理化指标异常: 温度改变 pH值异常变化;
(3)代谢异常 碳源消耗异常 氮源消耗异常
(3)发酵中期染菌
发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量 产酸,培养液pH下降;糖、氮消耗快,发酵液发粘,生 产菌大量死亡,菌丝自溶,产物分泌减少或停止,有时 甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭, 产生大量泡沫。
措施 降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情况。 如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐,如果是抗生 素生产,可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐, 抑制杂菌。
3、发酵染菌对产品质量的影响
➢杂菌种类繁多,其代谢产物亦多,且多属未知。这些代 谢产物,特别是某些杂菌产生的内毒素,能否在抗生素 等原料药分离提纯过程中全部除尽而不混入产品中很难 保证且难以监测(导致不能使用)。 ➢有些杂质混入产品中,还可影响产品的外观。(如土霉 素发酵染菌,在提炼过程中有棕黑色酸不溶物混进产品。
上海第三制药厂染菌原因分析
项目 种子带菌 盘管穿孔 阀门渗漏 空气系统有菌 管理不善 其它 原因不明
百分率% 14.15 14.20 23.30 10.0 25.80 7.49 5.78
管理不善而染菌的有31个罐批,占25.08%经分析有下表所列原因:
项目 进罐前未做设备严密度检查 接种违反操作规程 检修质量缺乏验收制度 操作不熟练 配料违反工艺规程 调度不当
日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析
项目 种子带菌或怀疑种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 总空气系统有菌 泡沫冒顶 夹套穿孔 盘管穿孔 接种管穿孔 阀门渗漏 搅拌轴密封渗漏 罐盖漏 其它设备渗漏 操作原因 原因不明
百分率% 9.64 0.19 0.79 19.96 0.48 12.36 5.89 0.39 1.45 2.09 1.54 10.13 10.15 24.94
(2)染菌对不同发酵产品的影响
➢青霉素发酵染菌:绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶, 而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在 发酵前期、中期或后期,染有能产生青霉素酶的杂菌,都 能使青霉素迅速破坏。
➢链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发 酵染菌那样一无所得,但也会造成不同程度的危害。如杂 菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢;改变pH,降低产 量。
(2)设备渗漏的原因
化学腐蚀:培养基的某些成分,调节pH的酸碱。不是 设备损坏的主要原因 磨蚀:培养基中的颗粒物质(黄豆饼粉、花生饼粉 等),混入的泥沙和金属异物。 设备加工不良:弯头、盘管焊接缝、阀门等。
2、空气带菌
空气系统导致染菌是发酵染菌的主要原因之一。 从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而 造成的染菌分别为19.96%和 26%。国内外空气除菌技术 虽已有较大改善,但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。 因为空气除菌系统较为复杂,环节多,偶遇不慎便会导致 空气除菌失败。
发酵前期最易染菌,且杂菌易迅速繁殖,消耗大量基质, 严重干扰生产菌正常生长,危害最大。
➢原因 发酵前期菌量少,与杂菌没有竞争优势;且 还未合成产物(抗生素)或产生很少,抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。 ➢染菌措施 可以用降低培养温度,调整补料量,用 酸碱调pH值,缩短培养周期等措施予以补救。如果前期 染菌,且培养基养料消耗不多,可以重新灭菌,补加一 些营养,重新接种再用。
三、造成染菌的主要原因总结
1、设备渗漏 (1)易渗漏的设备
设备渗漏包括发酵罐、夹套穿孔、盘管穿孔、接种管 穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。 从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现, 这类染菌占33.85%,上海三厂的分析这类染菌为37.5%。 所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查,对制服 染菌是极其主要的,也是重要的。
(4)发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物,特别是抗生素, 对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多,对 生产影响不大。如果染菌严重,又破坏性较大,可以提前 放罐。
如果是氨基酸和有机酸发酵,后期染菌也会影响产物 的产量,提取和产品质量。
二、染菌对发酵产品的提炼和产品质量的影响
1、染菌对过滤的影响