病毒性疫苗制造技术

病毒性疫苗制造技术
任务一灭活苗的制造流程
菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活
↓↓
配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ←浓缩
工序一菌种与种子培养
选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。

种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。

大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。

如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。

工序二菌液的培养
用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。

可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。

一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。

因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。

实例大肠杆菌的菌液培养方法
(1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。

(2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。

(3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。

如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。

吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。

如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计数用，其余细菌则灭活。

工序三菌数计算
采用活菌计数法或比浊计数法，以概略地计算出每毫升菌液中的细菌总数。

工序四灭活与浓缩
对大肠杆菌菌液应加入0.5％甲醛溶液，置37℃温箱作用48～72h，以达到杀死细菌的目的。

灭活后需对菌液进行浓缩，常用的浓缩方法有离心沉降法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法。

可使菌液浓缩1倍以上。

工序五配苗与分装
配苗就是在菌苗的制备过程中加入佐剂，以增强免疫效果。

由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不同。

例如,大肠杆菌氢氧化铝菌苗细菌计数所得原菌液的浓度，用灭菌生理盐水将其稀释成最终浓度为100亿～400亿个/ml。

按每5份菌液加入1份氢氧化铝胶配苗，同时加入0.01%硫柳汞，充分振荡，置2～8℃静止2～3d，抽弃上清液，浓缩成全量的60%。

塞上胶塞，用固体石蜡溶化封口，贴上标签，注明菌苗名称。

使用前充分摇匀。

,整个制备过程都必须在无菌条件下按照无菌操作进行
介绍常用灭活剂
1.甲醛
甲醛是最古典的、也是应用最广的一种灭活剂。

为无色气体，易溶于水和乙醇，其36％～40％水溶液称为福尔马林。

甲醛用于疫苗灭活的浓度为0.1％～0.5％。

一般需氧细菌用0.1％～0.2％的浓度，厌氧菌则多用0.4％～0.5％的浓度。

病毒可在0.05％～0.4％的之间，多数使用0.1％～0.3％。

2.苯酚又称石炭酸。

为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及腐蚀性，易潮解，溶于水及有机溶剂。

置于空气中易被氧化，应避光保存。

灭活机制是使微生物的蛋白质发生变性和抑制特异酶系统（如脱氨酶、氧化酶等）的活性，从而导致微生物死亡。

制作生物制品的常用浓度为0.3％～0.5％。

3.β-丙内酯又名为羟基丙酸-β-内酯，性状为不稳定，无色，有刺激气味的液体，是一种良好的病毒灭活剂。

β-丙内酯的灭活机制是破坏病毒的核芯，但不损害衣壳蛋白，因此能保持病毒良好的免疫原性，主要用于狂犬病灭活苗的制备。

4.结晶紫是一种带有金属光泽的绿色结晶或深绿色结晶状粉末的碱性染料，易溶于醇、氯仿，不溶于水和醚。

灭活机制主要是它的阳离子与微生物蛋白质的羧基形成带弱电的化合物，妨碍了微生物的正常代谢，扰乱微生物的氧化还原作用，使电势太高而不适于微生物的增殖，对革兰氏阳性菌主要是干扰细胞壁肽聚糖的合成。

5.硫柳汞又称乙基汞硫代水杨酸钠，为无色结晶或乳白色粉末，微有特殊气味，易溶于水和乙醇，不溶于乙醚和苯，应避光保存。

用于生物制品的防腐和消毒，对霉菌、细菌和病毒都有一定的灭活作用。

常用浓度为0.01％～0.02％。

6.烷化剂是含有烷基的分子中去掉一个氢原子与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。

其灭活机制是烷化微生物DNA、RNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双链交联，也可与酶系统和核蛋白起作用，破坏核酸代谢、合成，使病毒丧失感染力，但不损害蛋白衣壳，从而保留其抗原性。

这类烷化剂常用的有N-乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺及缩水甘油醛等。

介绍常用的免疫佐剂
(一)免疫佐剂的概念
免疫佐剂又称佐剂，是指单独使用没有免疫原性，与抗原物质合并使用能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用的一类物质。

其作用特点是：①对某些分子的相对质量小的多糖或多肽等抗原性微弱的物质，可明显增强其抗原性；②可用最小的抗原量、最少的接种次数，刺激机体产生足够的免疫应答和高滴度的抗体，在血流中或黏膜表面维持较长时间，发挥持久作用。

(二)常规免疫佐剂
1.铝盐类佐剂
(1)．氢氧化铝胶简称铝胶。

铝胶可用制造多种兽用疫苗。

(2)．明矾
(3)．磷酸三钙
2.弗氏佐剂
弗氏不完全佐剂是由3份液体石蜡油、1份无水羊毛脂、4份磷酸缓冲盐水（pH7.2）混合而成。

制造时，先将各成分混合均匀，116℃高压灭菌30min，冷却后加入1％吐温-80混匀，使用时与抗原物质等量混合。

弗氏完全佐剂是在不完全佐剂中加入杀死的分枝杆菌或卡介苗，按l～2mg／ml的量加入，使用时与抗原物质等量混匀。

3.油乳佐剂
油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。

4.蜂胶佐剂
蜂胶是由蜜蜂上颚腺的分泌物和由蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其他植物幼芽分泌的树脂以及蜂蜡、花粉等组成。

5.微生物佐剂
(三) 新型免疫佐剂
1.细胞因子类佐剂
白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）
白细胞介素-12（IL-12）γ-干扰素。

2.免疫刺激复合物(ISCOM)佐剂
任务二活疫苗的制造流程
弱毒疫苗的制造流程
菌种与种子→菌液培养→浓缩→配苗与冻干
工序一菌种与种子。

弱毒菌种多是冻干制品，在使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、免疫原性等鉴定，合格后将菌种接种于规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即作为种子液。

种子液保存在0～4℃，有效期2个月。

在保存期内用作菌苗生产的批量种子使用。

工序二菌液培养。

按培养基1%～3%的比例接入种子液，依不同菌苗的要求制备菌液。

如猪丹毒弱毒苗在深层通气培养中要加入适当植物油作消泡剂，并通入过滤除菌的热空气。

菌液于0～4℃暗处保存，经抽样无菌检验、活菌计数合格后使用。

工序三浓缩。

经上述检验合格的菌液进行浓缩，其目的是提高单位活菌数，进而提高某些弱毒菌苗的免疫效果。

常用的浓缩方法有吸附剂吸附沉降法和离心沉降法。

浓缩菌液应抽样作纯粹检验、无菌检验及活菌计数。

工序四配苗与冻干。

将检验合格的菌液按比例加入冻干保护剂（如5%蔗糖脱脂乳）配苗，充分摇匀后立即分装。

随后将菌苗迅速放入冻干柜预冻和真空干燥，并立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存后由质检部门抽样检验
介绍常用的冻干保护剂
（一）冻干保护剂的组成和分类
1．低分子物质又称为营养液，是一种均匀的混悬液，使微生物保持稳定的存活状态及对水分子起缓解作用，使冻干生物制品保留一定量水分，促进高分子物质骨架形成，使冻干制品呈多孔的海绵状，从而增加溶解度。

如糖类和氨基酸类（谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、赖氨酸）等。

2．高分子物质又称为赋型剂，在冻干生物制品中主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化；保护活性物质不受加热的影响；使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加。

高分子物质范围很广，种类甚多。

如白蛋白、血清、明胶、脱脂乳、各种液体培养基、淀粉、酵母浸膏、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素等。

3．抗氧化剂具有抑制冻干制品中酶的活化作用，从而促进、保持微生物等活性物质的稳定性。

抗氧化剂包括一些有机物质和无机物质，如维生素C、维生素E、硫脲、碘化钾、钼酸铵和硫代硫酸钠等。

(二)、冻干保护剂分类
1.根据冻干保护剂的化学性质分类
可分为复合物、糖类、盐类、醇类、酸类、碱类、聚合物等
2.根据冻干保护剂的作用机制分类⑴．渗透剂⑵．非渗透剂
(三)常用的冻干保护剂
1．5％蔗糖脱脂乳保护剂
2．脱脂乳-谷氨酸钠保护剂
3．7.5％葡萄糖血清保护剂
4．环乙醇-血清保护剂
5．喷雾干燥用保护剂
（四）不同微生物适用的保护剂
1．需氧和兼性厌氧菌可用5％蔗糖脱脂乳，或含1％谷氨酸钠的10％脱脂乳，或l0％脱脂乳与犊牛血清，或5％蔗糖，或1.5％明胶等。

2．厌氧菌可用10％脱脂乳，或7.5％葡萄糖加血清，或用含0.1％谷氨酸钠的10％乳糖等。

3．病毒可用明胶、血清、蛋白胨、乳糖、蔗糖、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮等，也可加入脱脂乳，或者几种成分混合配成保护剂。

4．支原体可用3％脱脂乳加5％葡萄糖混合液，或1％牛血清白蛋白，或50％健马血清，或7.5％葡萄糖加血清等。

5．立克次体常用10％脱脂乳。

6．酵母菌可用健步马血清，或7.5％葡萄糖加血清，或脱脂乳加谷氨酸钠和蔗糖等。

任务三类毒素的制造流程
类毒素的制造流程
菌种与毒素→脱毒→类毒素的精制
工序1菌种与毒素
应选用中监所分发或批准的产毒效价高、免疫力强的菌株，必要时可对菌种进行筛选。

菌种应定期作全面性状检查（如细菌形态、纯化试验、糖发酵反应、产毒试验及特异性中和试验等），并有完整的传代、鉴定记录。

菌种应用冻干或其他适宜方法保存在2～8℃。

选择适宜的培养基制造种子菌及毒素。

毒素制造过程应严格控制杂菌污染，经显微镜检查或纯化试验发现污染者应废弃。

毒素须经除菌过滤后方可进行下一步制造程序，亦可杀菌后进行精制。

工序2脱毒
目前采用最可靠的脱毒方法仍是甲醛溶液法，温度控制在37～39℃，终浓度控制在0.3%～0.4%。

脱毒后的制品即成粗制的类毒素。

经检验合格者，置2～8℃保存，有效期可达3年。

工序3类毒素的精制
用人工培养法所制得的粗制类毒素液含有大量的非特异性杂质，而毒素含量较低。

因此，有必要对类毒素进行浓缩精制，以获得纯的或比较纯的类毒素制品。

（1）物理学方法可用冷冻干燥、蒸发、超滤、冻融等方法除水浓缩；也可用氧化铝和磷酸钙胶等固相吸附剂吸附。

（2）化学沉淀法有酸沉淀法（盐酸、硫酸、磷酸、三氯醋酸等）、盐析法（硫酸盐、硫酸钠及磷酸盐缓冲液等）、有机溶剂沉淀法（甲醇、乙醇及丙酮等）和重金属阳离子沉淀法（Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+等，其中以氯化锌应用最广）。

（3）层析法有凝胶过滤和离子交换层析法。

类毒素精制后应加终浓度0.01%硫柳汞防腐，并尽快除菌过滤。

保存于2～8℃，有效期为3年。

实例猪链球菌蜂胶苗制备
1．材料与试剂
（1）器材：粉碎机或垫板和锤头.研磨器.量筒.玻璃棒.离心机.吸管等。

（2）试剂：95%酒精
2．蜂胶佐剂疫苗制备方法
（1）蜂胶的处理：
①用市售蜂胶，放4℃以下低温贮存，制备前用粉碎机或垫板和捶头在4-8℃下粉碎。

②过筛，按1：4加入95%乙醇，室温浸泡24-48h。

③冷却，过滤或离心取上清液，即得透明栗色纯净蜂胶浸液。

④除去干渣，计算出浸液中蜂胶含量，浸液置4℃以下保存备用。

（2）链球菌的培养
①将至病性链球菌接踵于普通肉汤培养基中，37℃震荡培养至细菌生长饱和状态。

②将菌液3000rpm 离心20min，弃去上清液，沉淀物用灭菌生理盐水或PBS液稀释至所需浓度，同时要求纯粹生长。

③将菌液灭活：在菌液中缓慢加入终浓度为0.5%的甲醛溶液，边加入变搅拌，使之完全混匀，置37℃灭活24h。

（3）蜂胶佐剂疫苗的制备：
在灭活菌液中加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中喊蜂胶10mg，边加边摇荡，迅即成为乳浊状，即为蜂胶佐剂疫苗。

（4）疫苗的检验
自制菌苗的检验主要为安全检验，取注射计量的5-10倍的剂量注射实验猪，猪在注射后应无异常反应，或反应很轻微。

任务四几种主要细菌性疫苗的制作
实例1布鲁氏菌19号活疫苗的制作
（1）菌种制苗菌种为牛种布鲁氏菌弱株A19，其生物学特性典型。

（2）制备工序
工序1种子繁殖冻干菌种接种于胰蛋白琼脂平板培养基上,于36-37℃培养2-3d,选取典型菌落,再次接种于胰蛋白琼脂平板营养48-72h,作为种子.
工序2菌液培养按培养基总量的1%-2%将种子液接种于马丁肉汤,在 36-37℃下通气培养36h 期间于第12h、20h、28h分别按培养基总量的 1%-2%加入50%葡萄糖溶液。

纯粹检验合格。

工序3浓缩与配苗将菌液用PH6.3-6.8缓冲生理盐水稀释成120亿-160亿个/ml,无菌分装即为湿苗,若制冻干苗,按总量的 0.2%_0.4%加入羧甲基纤维素钠,浓缩沉淀菌体.浓缩的菌液纯粹检验及活菌计数合格后,加入PH7.0的蔗糖明胶稳定剂进行配苗,定量分装,迅速冷冻真
空干燥.
实例2仔猪大肠杆菌三价灭活苗制作
（1）菌种制苗用菌种为C83549.C83644.C83710菌株,检验用菌种,检验用菌种为 C83902
C83912 C83917菌株.要求用相应的 K88 K99和987P因子血清做平板凝集反应,达到强阳性反应.
（2）制备工序
工序1种子繁殖将各株冻干菌种接种改良Minca汤中培养后,用改良Minca琼脂平板划线分离,选取典型菌落若干,分别用相应的 K88 K99和987P因子血清逐个做平板凝集反应,选取强阳性反应菌落,接种改良Minca汤中培养,作为一级种子.取一级种子按上述方法繁殖,革兰氏染色镜检后 ,无杂菌者作为二级种子.
工序2菌液制备将二级种子进行连续通气培养,搅拌速度为600r/min，通气量大于1：1，第一代通气培养7h，取样检验合格，即收获，并按加入培养基的3%-5%留有种子，然后加入培养基，通气培养6-7h，再收获，如此循环培养，但最多吧超过10代。

培养温度为36-37℃，0.01%花生油为消泡剂。

工序3配苗与分装按总量加入20%氢氧化铝胶，最后补加PBS和 0.01%硫柳汞，每1ml成品苗中应含有K88100个抗原单位、K99 50个抗原单位、987P50个抗原单位、菌种≦200亿个。

经无菌检验合格后，进行混合、分装。

实例3猪丹毒灭活疫苗
本疫苗是用免疫原性两好的B型猪丹毒杆菌，接种于适宜培养基中培养，培养物经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶浓缩后制成。

用于猪丹毒的预防。

皮下或肌肉注射，体重在10kg以上
的断奶猪5ml；未断奶仔猪3ml，间隔1个月后，再注射3ml，注射后多无不良反映，但有时注射部位出现硬结，可逐渐消失。

免疫期为6个月。

活疫苗国内猪丹毒弱毒疫苗使用菌株很多，目前，我过猪丹毒弱毒疫苗生产中
广泛使用是GC
42和G
4
T
10，
两个菌株。

实例4猪丹毒GC
42
活疫苗
将GC
42
弱毒菌株接种与明胶平板上进行培养，选取呈分支状生长的典型菌落，接种在血液琼
脂斜面上培养作为菌种。

制苗时再将斜面培养物接于肉肝肠膜消化汤。

37℃培养20h将培养物作为种子液，按1%接种于含2%血清或裂解红细胞全血的肉肝肠膜消化汤，35-37℃培养20h 经菌数计算和纯粹检验后，7份菌液与1份明胶蔗糖保护剂混合分装冻干即成。

分头份活菌
GC
42
应不低于7亿个.安全检疫用小白鼠应全部健活.-15℃保存,有效期1年;2-8℃保存,有效期9个月.使用时,按瓶签标定的头份加入20%铝胶生理盐水稀释溶解,每头猪皮下注射1ml,疫苗
稀释后,限4h内用完, GC
42
疫苗亦可用于口服,口服时剂量加倍,口服前应停食4h,免疫后7-9天产生免疫力.断奶猪免疫期可达6个月.
任务五细菌性疫苗生产中的主要设备
仪器设备:超净工作台恒温培养箱灭菌平板灭菌试管培养病毒的方法:动物培养,组织培养,细胞培养
任务一病毒性组织疫苗的制备
流程：动物选择→ 种毒与接种→观察与收获→制苗
工序1动物选择
动物质量对组织疫苗的质量有着直接影响，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用。

所选择的动物应是SPF动物，对所接种的病毒易感性高，在品种、年龄和体重等方面应合乎要求。

工序2种毒与接种
种毒既可用强毒株的脏器组织毒或增菌培养物，也可用弱毒株的组织毒。

无论何种种毒都必须经纯粹性、抗原性等检查合格后使用。

无疑，生产不同批次的疫苗也可使用同一批检验合格的种毒批，以减少疫苗批次间的质量差别。

将检验合格的种毒接种到动物体内进行病毒的增殖培养。

种毒的接种途径依病毒性质和目的而异。

如猪瘟结晶紫疫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾、淋巴结毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内感染。

工序3观察与收获
动物在接种毒种后应每天观察和检查规定的各项指标，常规检查的项目有食欲、精神、活动状态、体温、粪尿和血液变化等。

根据观察和检查的结果选出符合要求的发病动物，按。

规定方式剖杀，采取、收集含毒量高的器官组织，用于制备疫苗。

如兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产，猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备，狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。

工序4制苗
（1）组织灭活疫苗收获的含毒组织经无菌检验及毒价测定合格后按规定比例加入平衡液和灭活剂(甲醛、酚、结晶紫等)制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。

如猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份、结晶紫甘油溶液1份混合，于37～38℃减毒6～8d制成。

（2）弱毒组织疫苗在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，
称重后剪碎，加入适量保护剂制成匀浆，然后过滤去除残渣，按实际滤过的组织液计算稀释倍数，加入余量保护剂即为原苗。

原苗按100IU（μg）/ml加入青、链霉素，摇匀后置4℃作用一定时间，作无菌检验与毒价测定，合格者进行分装、冷冻真空干燥制成冻干疫苗。

任务二病毒性禽胚培养疫苗的制备
流程：禽胚的选择与孵化→种毒与毒种的继代→ 接毒与收获→配苗
工序1禽胚的选择与孵化
生产用的鸡胚应来自SPF鸡群或未用抗生素的非免疫鸡群的受精卵，蛋壳为白色且薄厚均匀。

按常规无菌孵化至所需日龄用于接种。

工序2种毒与毒种的继代
种毒应由国家菌、毒种保藏部门供应，适应于鸡胚的种毒多系弱毒且为冻干毒种，使用前需在鸡胚上继代复壮3代以上和检验合格后方可用于生产。

毒种鉴定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的鉴定等。

工序3接毒与收获
鸡胚接毒可根据不同的病毒与不同疫苗生产程序选择最佳接种途径和最佳接种量，目的在于获得最高的毒价。

接种途径常采用尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种和卵黄囊接种。

工序4配苗
按规定收获的尿囊液和卵黄囊液经无菌检验合格后，可直接配苗。

胎体和绒毛尿囊膜需剪碎制成乳剂后，再经无菌检验合格，方可配苗。

（1）湿苗将经无菌检验合格的病毒液按规定加入双抗（青、链霉素），放置2～8℃冷暗处处理后分装。

（2）冻干苗将无菌检验合格的病毒液，按1∶1比例加入保护剂（5%蔗糖脱脂乳），按规定加入双抗，混匀后分装冻干。

（3）灭活苗(佐剂苗) 将无菌检验合格的病毒液，加入适当浓度的灭活剂，在适当条件下灭活后，再加入佐剂，充分混匀后分装。

任务三病毒性细胞培养疫苗的制备
流程：种毒与毒种→营养液配制与细胞制备→接毒与收获→配苗
工序1种毒与毒种
种毒由国家指定的菌、毒种保藏部门鉴定分发，多为冻干品。

按规定在细胞中继代培养后用作毒种。

继代培养控制在一定代数以内。

工序2营养液配制与细胞制备
营养液通常分为细胞培养用的生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的是生长液血清含量为5％～20％，维持液血清含量仅有0％～5％。

不同细胞需要不同的营养成分，根据需要选择合适的营养液。

常用的营养液有乳汉液、MEM、DMEM、199、1640等，只需溶解后经除菌过滤即可使用。

工序3接毒与收获
病毒接种可与细胞同步（分装同时或分装不久后接种病毒）或异步（细胞形成单层后接种病毒）。

待出现70%～80%以上细胞病变时即可收获。

收获时可将培养瓶反复冻融后收取；也可加EDTA-胰酶液消化分散收获。

收获的细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后，供配苗用。

工序4配苗
灭活疫苗和冻干苗的配制方法见禽胚培养疫苗。

任务四几种主要病毒性疫苗的制备
一、猪传染性胃肠炎H-5活疫苗
将自然强毒株通过猪肾细胞传代120代的细胞弱毒株，经4次克隆纯化作为疫苗株。

取其150代以内的细胞毒，在猪肾原代细胞增值后制成冻干苗和佐剂灭活苗。

活疫苗毒价不低于
107.0TCID
50/0.3ml。

灭活疫苗不低于108.3TCID
50
/ml。

一般免疫两次，第一次给妊娠6周内母猪
鼻内喷雾接种弱毒活疫苗1ml，第二次在产前2-3周肌肉注射灭活疫苗1ml。

二、猪传染性胃肠炎华毒株活疫苗
该制苗种毒是华27细胞弱毒株。

该毒株通过胎猪肾细胞传代至弱，是将华27-4肠组织强毒通过加有二甲基亚砜的猪胎肾原代细胞传代至弱，在92-165代之间5次克隆纯化，挑选直径
小于1mm的小空斑再传代。

100代后以后的毒价为104.67 -106.0TCID
/0.3ml。

妊娠母猪在产
50
前45d及15d左右进行肌肉注射和滴鼻各1ml，仔猪获得的被动免疫的保护率达95%以上。

三、马立克氏病火鸡疱疹病毒（HVT）活疫苗
1种毒制苗用种毒为FC
毒株。

用10000PFU以上剂量由卵黄囊接种4-5日龄鸡胚，观察至
126
18-19日龄，应不致死鸡胚。

2制备要点种毒接种于鸡胚呈纤维细胞，上复壮继代1-2代，选择培养48-72h，CPE达70%
等，以上者，收获并作为种子毒液。

常用的细胞培养液包括包括199、MEM、199-HL、199-F
10
另外加0.5%-2%犊牛血清和 5%-10%磷酸胰蛋白肉汤。

以1：60-1：100细胞感染比接毒，37℃培养 64-72h，待CPE达60%时用1：4-1：6胰酶-EDTA消化细胞，加入适量营养液后离心收集沉淀细胞。

然后加入适量SPGA稳定剂悬浮细胞，用超声波裂解器进行裂解，即为原苗。

然后配苗、分装、冻干即可。

四、猪瘟活疫苗I-----猪瘟兔化弱毒兔体组织活疫苗制备
1种毒猪瘟兔化弱毒”C株”.注射家兔后发生定型热反应,体温超过常温1-1.5℃维持18—24h
2制备要点选择健康的 1.5—3kg体重家兔.用20—25倍生理盐水稀释的脾乳剂.活脾磷乳剂,静脉注射1ml,定期测定其体温.选择定热型反应兔和轻热反应兔,并在其体温下降到常温后24h内剖杀.在无菌条件下采取脾脏和淋巴结供制备脾淋苗用.采取脾.淋巴结.肝.肺,去除脂肪.结缔组织.血管.胆囊.及病灶部,供生产混合苗用.制备混合苗时,肝脏用量不超过淋
巴结.脾重量的2倍,将组织称重后剪碎,加入适量5%蔗糖脱脂乳保护剂,混合研磨后去除残渣,按实际率过的组织液计算稀释倍数,加入余量保护剂为原苗.每毫升原苗可加青霉素.链霉素
各500—1000IU,摇匀.至4℃条件下作用一定时间后即可分装.冻干.
实例1鸡新城疫油苗制备
（一）培养病毒按实习四将鸡新城疫病毒接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h 收获病毒，供检测与制苗用。

（二）灭活尿囊液中新城疫病毒
1．灭活方法在尿囊液中加入0.1%甲醛溶液充分振摇后入37℃温箱灭活18h，每隔2～3h振摇一次，置4℃冰箱备用。

2．灭活尿囊液残毒检验取灭活后的尿囊液2ml，接种10日龄SPF鸡胚或非免疫鸡胚10枚，每胚0.2ml，置37℃温箱培养5d后观察，鸡胚应发育正常，无病变；逐个检测血凝价，HA≤1:16方可判灭活符合要求。

3．无菌检验取1ml灭活毒液加入49ml硫乙醇酸盐培养基中，培养72h后移植到葡萄糖蛋白胨水培养基中和酪胨琼脂培养基上培养5d，应无细菌生长。

（三）鸡新城疫油苗的制备
1．配制油苗（油包水型W/O）
（1）配制水相取灭活毒液96ml、吐温-80 4ml于三角瓶中，混合后充分振摇，即成水相。

（2）配制油相取白油94ml、司本-80 6ml、硬脂酸铝2g于三角烧瓶中，置电炉上加热溶解至透明，冷却至室温。

在生产实践中，油相配好后需经高压灭菌后方可用来配苗。

（3）乳化将油相与水相按照3:1～2:1的比例配制。

实验时如无胶体磨，可采用手工乳化法，方法为将油相装入三角烧瓶中，边摇边缓慢加入水相，水相加完后，充分振摇0.5～1h。

在生物制品厂采用机器乳化法，将油相置于胶体磨或高压匀浆泵中，高速搅拌进行乳化。

（四）油苗的检验
1．物理性状检验
①外观乳化后的W/O型油苗应呈乳白色粘稠状。

②剂型用1ml洁净吸管吸取油苗滴入冷水中。

油滴不扩散为油包水型（W/O），油滴呈云雾状扩散的为水包油型（O/W）。