基质金属蛋白酶2,9及金属蛋白酶组织抑制因子1,2在大鼠失神经骨骼肌的表达及意义

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
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·研究原著·
陈波，男，1971年生，湖北省随州市人，汉族，2010年华中科技大学同济医学院毕业，硕士，主任医师，主要从事创伤和手外科研究。

通讯作者：陈振兵，华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科，湖北省武汉市 430022
中图分类号:R318 文献标识码:A
稿件接受：2017-12-13
Chen Bo, Master, Chief physician, Department of Orthopedics, People’s Hospital of China Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China
Corresponding author: Chen Zhen-bing, Department of Hand Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
基质金属蛋白酶2，9及金属蛋白酶组织抑制因子1，2在 大鼠失神经骨骼肌的表达及意义
陈 波1，梁 杰1，陈振兵2 (1三峡大学人民医院骨科，湖北省宜昌市 443000；2华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科，湖北
省武汉市 430022)
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0083 ORCID: 0000-0002-3825-0051(陈波)
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文题释义：
基质金属蛋白酶：在正常组织中，基质金属蛋白酶的表达非常低，当组织重塑需要时它们迅速被诱导产生和激活。

基质金属蛋白酶由肌内纤维母细胞、许旺细胞、轴突和肌卫星细胞产生。

基质金属蛋白酶的分泌和释放开始表现为非活性的前酶原，通过破坏锌-半胱氨酸结合而暴露了催化位点，结果是酶的空间活化的中间形式能通过自体催化，去掉前肽区而成为在细胞外环境成为有活性的成分，这就是所谓的半胱氨酸-开关机制。

失神经骨骼肌：指因各种原因(如创伤、人为切断神经等)所致骨骼肌失去神经支配的情况，由于神经再生速度极为缓慢，当骨骼肌重新获得神经支配时，已经发生了不可逆转的萎缩，最终甚至造成肌肉功能的丧失。

目前关于骨骼肌失神经后萎缩的机制研究尚不够完善，有研究表明血管床重塑、肌细胞凋亡、肌卫星细胞耗竭等机制参与了这一过程。

摘要
背景：基质金属蛋白酶及其组织抑制因子参与正常和病理情况下细胞外基质的重塑，研究表明基质金属蛋白酶2，9在骨骼肌损伤、失用等过程中都有表达，在其中具有重要的生理病理作用。

目的：分析基质金属蛋白酶2，9及其组织抑制因子1，2在失神经骨骼肌中的表达及意义。

方法：将大鼠右侧坐骨神经切断建立失神经骨骼肌模型，分别于术后不同时间段取右侧失神经的腓肠肌，
采用苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、定量荧光检测技术检测大鼠骨骼肌组织形态学变化，并对比基质金属蛋白酶2，9及其组织抑制因子1，2的表达，与假手术组进行对照。

结果与结论：①坐骨神经切断后腓肠肌出现萎缩纤维化的变化；②基质金属蛋白酶2和组织抑制因子2在 3 d 及56 d 时出现双高峰，基质金属蛋白酶9在3 d 及70 d 时出现双高峰，而组织抑制因子1在3 d 时达到高峰后逐渐下降至正常，无第2个高峰出现；③提示基质金属蛋白酶及其组织抑制因子参与失神经肌肉组织的变化，组织抑制因子1，2对重塑进程有保护作用。

基质金属蛋白酶及其组织抑制因子在失神经骨骼肌退变的不同阶段为维持组织完整性发挥着重要作用。

关键词：
失神经骨骼肌；萎缩；纤维化；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶9；金属蛋白酶组织抑制因子1；金属蛋白酶组织抑制因子2；国家自然科学基金 主题词：
肌，骨骼；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶9；组织工程 基金资助：
国家自然科学基金资助项目(81271967) 缩略语：
基质金属蛋白酶：matrix metalloproteinases, MMPs ；金属蛋白酶组织抑制因子：tissue Inhibitor of metalloproteinases, TIMPs
Chen B, Liang J, Chen ZB. Expression and effects of matrix metalloproteinase 2 and 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and 2 in the denerved skeletal
muscle of rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(4):516-522. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0083 Expression and effects of matrix metalloproteinase 2 and 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and 2 in the denervated skeletal muscle of rats
Chen Bo1, Liang Jie1, Chen Zhen-bing2 (1Department of Orthopedics, People’s Hospital of China Three Gorges University, Yichang 443000, Hubei Province, China; 2Department of Hand Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMP) are involved in the remodeling of extracellular matrix under normal or pathological conditions, and the positive expression of MMP-2 and MMP-9 has been shown to play important physiological and pathological roles in the denervated skeletal muscle.
OBJECTIVE: To investigate the expression and effect of MMP-2 and MMP-9 and their tissue inhibitors (TIMP-1 and TIMP-2) in the denervated skeletal muscle.
METHODS: The right sciatic nerve of rats was cut off to establish the model of denervated skeletal muscle, and the right skeletal muscle of rats was harvested after different intervals. The morphologic changes of the denervated skeletal muscle were detected through hematoxylin-eosin staining, immunohistochemical staining, and RT-PCR. The expression and change of MMP-2 and MMP-9 and TIMP-1 and TIMP-2 were compared with the sham operation group.
RESULTS AND CONCLUSION: Atrophy and fibrosis were observed in the denervated skeletal muscle. There was a rapid increase of MMP-2 and TIMP-2 with double peaks at the 3rd and 56th days after modeling; at the 3rd and 70th days, the expression of MMP-9 increased significantly and reached the peak respectively; mRNA level of TIMP-1 only increased in the early stage, reached the peak at the 3rd day and gradual declined to normal level, without the second peak. To conclude, MMPs and TIMPs are involved in the tissue changes following denervation. TIMP-1 and TIMP-2 have a protective role in the remodeling progression. The altered balance between MMPs and TIMPs in the late stage of denervation may be responsible for extracellular matrix degradation leading to the atrophy and fibrosis progression.
Subject headings: Muscle, Skeletal; Matrix Metalloproteinase 2; Matrix Metalloproteinase 9; Tissue Engineering
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81271967
0 引言Introduction
骨骼肌失神经支配后，由于神经营养因子丢失导致细胞形态结构、生理、生化及新陈代谢等方面的改变，最典型的是出现肌萎缩，组织形态学变化表现为肌纤维直径及横截面积的减少，超微结构表现在肌细胞表面早期就出现运动终板的消失和肌纤维周围基质的改变。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类对细胞外基质有广泛降解作用的蛋白水解酶，是调节基质的动态平衡的最重要的一大酶系，其活性可以被特异性的金属蛋白酶组织抑制因子(tissue Inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)所调控。

MMPs和TIMPs参与正常和病理情况下的细胞外基质的重塑，研究表明MMP-2，MMP-9在骨骼肌损伤、失用等过程中都有表达，在其中具有重要的生理病理作用[1]。

文章探索MMP-2，MMP-9及其特异性的组织抑制因子TIMP-1，TIMP-2在失神经骨骼肌中的变化，证实其参与失神经后的组织变化，探讨MMP-2，MMP-9及TIMP-1，TIMP-2在失神经骨骼肌萎缩过程中的作用及机制。

1材料和方法Materials and methods
1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年8至11月在华中科技大学同济医学院实验中心完成。

1.3 材料
1.3.1 实验动物清洁级健康成年雄性SD大鼠58只，体质量(200±15) g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。

适应性喂养1周后，采取随机数字表法分为2组：①失神经支配模型组55只，分别分为术后第1，2，3，4，7，14，21，28，42，56，70天组，共11组，每组5只；②假手术组3只。

按分组不同及实验时期不同单笼喂养。

1.3.2 试剂及仪器MMP-2多克隆抗体(YT2798，美国Immunoway公司)；MMP-9单克隆抗体(YMO447，美国Immunoway公司)；标准分子量核酸DNA Marker DL-2000(中国，北京天根生物科技有限公司)；普通pCR 试剂盒2×Taq pCR Master Mix(Fermentas，美国Thermo 公司)；RNA抽提试剂RNAiso Plus(Fermentas，美国Thermo公司)；荧光定量PCR试剂盒：Faststart Universal SYBR Green Master(FermentaS，美国Thermo公司)；所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成；塑料耐高温切片架、不锈高高压锅、孵育盒、恒温箱；病理组织切片机(RM2315型，德国Leica公司产品)；包埋机(490型，日本SAKURA FINETECHNICAL公司产品)；显微镜(德国Carl ZeiSS公司)多通道PCR扩增仪MJ公司美国。

1.4 方法
1.4.1 实验模型建立大鼠用1%戊巴比妥钠生理盐水溶液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待麻醉起效后，手术区域常规脱毛、消毒、铺巾。

取大鼠右下肢背侧纵形切口，显露并锐性游离坐骨神经，行以下处理：①坐骨神经切断的失神经支配模型：在距离梨状肌下缘的5 mm处切断坐骨神经，切除坐骨神经远端5 mm，将坐骨神经远端用8-0尼龙线结扎，并将其神经外膜固定到内侧的肌肉表面，但不产生挤压，神经近端套上一端为盲端的塑料胶管，防止断端神经生长到一起。

以麻醉清醒后观察到大鼠右下肢各趾屈曲畸形为造模成功标准；②阴性对照组仅暴露坐骨神经，并不给予其他处理。

逐层关闭至皮肤，活力碘消毒切口。

1.4.2 实验取材失神经支配模型组于术后的第1，2，3，4，7，14，21，28，42，56，70天时间点，分别取大鼠
陈波，梁杰，陈振兵. 基质金属蛋白酶2，9及金属蛋白酶组织抑制因子1，2在大鼠失神经骨骼肌的表达及意义[J]. 中国组织工程研究，2018，22(4):516-522. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0083
手术侧、正常侧的腓肠肌，假手术组分别取大鼠假手术侧、正常侧的腓肠肌，观察大鼠各侧肌肉的形态，颜色及厚薄程度。

切除肌腹两侧的肌腱，取一小块肌腹组织放置于40 g/L多聚甲醛中性溶液中固定，常规包埋石蜡切片，剩余的肌腹组织液氮中速冻，-80 ℃冰箱冻存，待行mRNA、蛋白含量检测。

1.5 主要观察指标
1.5.1 苏木精-伊红染色观察肌纤维切片中的数目以及肌纤维间隙的纤维成分，细胞成分，血管，神经组织等。

1.5.2 免疫组织化学染色观察黄色的MMP-2、MMP-9免疫复合物颗粒在各个时间点的肌肉组织中的分布状态。

苏木精-伊红染色、免疫组化染色切片的选取均按照各时间点分别选取，每只大鼠制作切片10枚，每个时间点计50枚；PCR选取标本数量亦为各时间点分别选取，每只大鼠选取10个标本，每个时间点计50个标本。

1.5.3 实时荧光定量PCR(RT-PCR) 检测腓肠肌中MMP-2，MMP-9及其抑制因子TIMP-1，TIMP-2的总mRNA 表达：①提取总mRNA；②反转录反应；③RT-PCR反应：应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术行RT-PCR，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值，结果使用2-∆∆Ct法分析。

在NCBI gene bank查到相应的基因序列，采用Oligo 5.0进行引物设计，然后在NCBI上进primer blast，采用评分最高的引物序列。

并由上海生工生物工程有限公司合成；
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料用百分比表示，同时进行卡方检验；计量资料用x_±s 表示，同时进行t 检验，P < 0.05时为差异有显著性意义。

2结果Results
2.1 实验动物数量分析纳入58只大鼠，按骨骼肌失神经支配天数设置11个实验组(n=5)和1个假手术对照组(n=3)，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 苏木精-伊红染色结果正常及假手术组的大鼠腓肠肌苏木精-伊红染色后呈现出一整齐的外观：肌纤维呈红色，肌纤维外膜清晰，细胞核小而规则，位于肌纤维周边；细胞外的纤维成分及其他细胞成分少；肌纤维间隔间有淡红丝状的结缔组织分割；血管边界清晰，血管周围红色的结缔组织排列有序，肌束膜红染，肌肉内的神经纤维排列整齐(图1A)。

坐骨神经切断后，肌纤维呈现出一个溶解、增生、重构的过程(图1B-F)：部分细胞细胞质透明样坏死变性，血管周围的结缔组织中含有大量的蓝染较深且体积较小的炎性细胞；肌纤维周径变小，肌纤维变性数目较前明显增多，细胞淡染，肌纤维间质中红染的纤维成分增多；肌纤维间结缔组织成分逐渐增多，血管管腔变小，周围结缔组织增多增厚，肌纤维被间质成分分割。

2.3 免疫组织化学染色结果正常的肌肉组织中(图2A)，MMP-2、MMP-9肌纤维组织中表达零星出现，表达很少，而血管壁周围则表达较多。

神经切断后的早期(1，2 d)，MMP-2在肌纤维和肌束间的几乎没有表达；在神经切断后的第3，4天(图2B，C)，发现大量的MMP-2出现在肌纤维膜中。

肌纤维膜结构分辨不清，肌纤维间距增宽，黄染的MMP-2颗粒沿其间的纤维性的基质分布；血管壁及周围的间质也有大量的黄染颗粒沉积。

坐骨神经切断术后第7天，MMP-2黄染颗粒少见，主要集中在血管周围。

坐骨神经切断术后第21-42天期间(图2D)，MMP-2表达出现一个缓慢变化过程，主要在肌纤维之间的细胞外基质以及肌纤维膜周围分布，肌纤维膜之间还有较多的含黄染颗粒的细胞，肌束间的纤维成分逐渐增加，黄染颗粒沿纤维成分分布，其中亦含有大量的炎性细胞。

术后的第56-70天(图2E，F)，细胞外的MMP-2逐渐减少，肌纤维间的MMP2黄染颗粒减少，肌束间的黄染颗粒亦减少。

MMP-9表达变化也呈现一个大致相同过程(图3)，术后14 d内呈现出一个先增加后减少的趋势。

术后第4天(图3C)，纤维细胞结构不清，肌纤维间隔中未见黄染颗粒的出现，肌束膜表面呈现出黄染的颗粒样物质，血管壁及周围纤维组织亦含有黄染的颗粒物质；术后7 d内，肌纤维细胞间与肌纤维边缘可见淡染的黄色颗粒沉积；14 d时，肌纤维间少量黄染颗粒沉积，肌纤维间的纤维及细胞成分明显，肌纤维细胞变小，密集明显，肌束上面有较少黄染颗粒沉积；术后21 d(图3D)，肌纤维间的炎性细胞成分含量明显增多，MMP-9黄染颗粒也出现在血管周围及其肌束间的纤维膜，肌纤维间未发现黄染颗粒存在。

通过统计学分析MMP-2和MMP-9的蛋白阳性表达率发现，术后呈现出先增加后减少的趋势，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

2.4 MMP-2，MMP-9及TIMP-1，TIMP-2的RT-PCR结果分析
2.4.1 MMP-2，MMP-9 mRNA表达正常的肌肉组织中MMP-2、MMP-9表达很少。

在神经切断后的3 d，MMP-2、MMP-9 mRNA表达显著增高达到第1个高峰，差异有显著性意义(P < 0.01)；在神经切断后的4-42 d，MMP-2 mRNA 表达逐渐降低，但仍然达正常肌肉组织的2倍以上，MMP-9 mRNA则降低至正常肌肉的水平。

在神经切断后的56，70 d ，MMP-2，MMP-9 mRNA表达分别出现第2个高峰，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表2及图4，5。

2.4.2 TIMP-1，TIMP-2 mRNA的表达与MMP-2，MMP-9 mRNA类似，TIMP-1，TIMP-2 mRNA表达在神经切断后的3 d达到10倍于正常肌肉组织水平(P < 0.01)；但随后二者出现分化，TIMP-1 mRNA表达在神经切断后的4-70 d降低至正常水平(P > 0.05)，没有第2个高峰出现；TIMP-2 mRNA表达在神经切断后的4-42 d逐渐降低至正常水平(P > 0.05)，56 d出现第2个高峰，达到正常肌肉组织中12倍的水平，然后下降，70 d仍为正常肌肉组织中2倍的水平(P < 0.01)，见图6，7。

Chen B, Liang J, Chen ZB. Expression and effects of matrix metalloproteinase 2 and 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and 2 in the denerved skeletal
muscle of rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(4):516-522. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0083
运用RT-PCR 技术检测实验中各个时间点MMP-2，MMP-9及TIMP-1，TIMP-2的mRNA 水平，坐骨神经切断后各时间点组和假手术组比较，进行统计学分析，同时对MMP-2，MMP-9及TIMP-1，TIMP-2的mRNA 水平进行相关性进行分析(表3)，相关系数均具有统计学意义(P <
0.01)，提示具有相关性。

3 讨论 Discussion
周围神经损伤后，骨骼肌最典型的变化是出现肌萎缩。

在这个过程中，细胞外基质中的蛋白发生降解，其所依赖
图1 大鼠骨骼肌苏木精-伊红染色(×400)
Figure 1 Hematoxylin-eosin staining results of the rat skeletal muscle (×400)
图注：图A 示正常的肌纤维完整，排列整齐，纤维成分罕见；B 示坐骨神经切断后3 d ，肌纤维肿胀明显，炎性细胞可见，纤维成分少见；C 示术后4 d ，肌纤维细胞可见变性坏死，间隙增加；D 示术后21 d ，肌纤维直径小，细胞间间质成分增加；E 示术后56 d ，肌纤维成分显著增
多；F
示术后70 d ，肌纤维间隙基质成分显著增多。

A
B C
D
E
F
图2 大鼠骨骼肌基质金属蛋白酶2(MMP-2)染色(×400)
Figure 2 Matrix metalloproteinase 2 expression in the rat skeletal muscle (immunohistochemical staining, ×400)
图注：图A 示正常肌纤维中未黄染的免疫颗粒；B 示坐骨神经切断后3 d 黄染的MMP-2颗粒沿其间的纤维性的基质分布，血管壁及周围的间质也有大量的黄染颗粒沉积；C 为术后4 d ；D 为术后21 d ；E 为术后56 d ；F 为术后70 d 。

A
B
C
D
E
F
图3 大鼠骨骼肌基质金属蛋白酶9(MMP-9)染色(×400)
Figure 3
Matrix metalloproteinase 9 expression in the rat skeletal muscle (immunohistochemical staining, ×400) 图注：图A 为正常肌纤维；B 为坐骨神经切断后3 d ；C 为术后4 d ；D 为术后21 d ；E 为术后56 d ；F 为术后70 d 。

A
B
C
D
E
F
失神经支配天数(d)
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 M M P -2 m R N A 相对表达量
正常 1 2 3 4 7 14 21 28 42 56 70
a a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
图4 坐骨神经切断后不同时间点肌肉中基质金属蛋白酶2(MMP-2) mRNA 表达变化(x _
±s )
Figure 4 Changes in the mRNA expression level of matrix metalloproteinase 2 in the rat denervated skeletal muscle at
different time points
图注：与假手术组(正常)相比，a
P < 0.05，b
P < 0.01。

失神经支配天数(d)
1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
M M P -9 m R N A 相对表达量
正常 1 2 3 4 7 14 21 28 42 56 70
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
图5 坐骨神经切断后不同时间点肌肉中基质金属蛋白酶9(MMP-9) mRNA 表达变化(x _
±s )
Figure 5 Changes in the mRNA expression levels of matrix metalloproteinase 9 in the rat denervated skeletal muscle at different time points
图注：与假手术组(正常)相比，a
P < 0.05，b
P < 0.01。

陈波，梁杰，陈振兵. 基质金属蛋白酶2，9及金属蛋白酶组织抑制因子1，2在大鼠失神经骨骼肌的表达及意义[J]. 中国组织工程研究，2018，22(4):516-522. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0083
的最重要的蛋白酶是MMPs ，以允许外形的改变、细胞移行和组织重塑。

MMPs 通过裂解肽腱能够降解细胞外基质的所有成分，其活性主要通过内源性的TIMPs 来抑制[2]。

在正常组织中，MMPs 的表达非常低，当组织重塑需要时它们迅速被诱导产生和激活。

MMPs 由肌内纤维母细胞、许旺细胞、轴突和肌卫星细胞产生。

MMPs 的分泌和释放开始表现为非活性的前酶原，通过破坏锌-半胱氨酸结合而暴
露了催化位点，结果是酶的空间活化的中间形式能通过自体催化，去掉前肽区而成为在细胞外环境成为有活性的成分[3]，这就是所谓的半胱氨酸-开关机制。

未加抑制的MMPs 活性将导致严重的组织损害，促使疾病的发生。

MMPs 的活性在3个方面调节：基因表达、酶原的激活和酶的抑制。

组织或细胞外的MMPs 活性通过内源性的TIMPs 和基质金属蛋白酶抑制因子来抑制，血浆中的MMPs 活性主要通过α2-巨球蛋白和相应的蛋白质抑制，TIMPs 是其中最重要的抑制因子，MMPs 的所有活性形式都被TIMPs 抑制。

TIMPs 包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。

TIMPs 包含两个域，在细胞外
失神经支配天数(d)
14
12 10 8 6 4 2
T I M P -1 m R N A 相对表达量
正常 1 2 3 4 7 14 21 28 42 56 70
a
b
b
b
b
b
b b
b
b
b
图6
坐骨神经切断后不同时间点肌肉中金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1) mRNA 表达变化(x _
±s ) Figure 6 Changes in the mRNA expression levels of tissue inhibitor of metalloproteinase 1 in the rat denervated skeletal
muscle at different time points
图注：与假手术组(正常)相比，a
P < 0.05，b
P < 0.01。

失神经支配天数(d)
正常 1 2 3 4 7 14 21 28 42 56 70
14 12 10 8 6 4 2 0
T I M P -2 m R N A 相对表达量
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
图7 坐骨神经切断后不同时间点肌肉中金属蛋白酶组织抑制因子2 (TIMP-2) mRNA 表达变化(x _
±s )
Figure 7 Changes in the mRNA expression levels of tissue inhibitor of metalloproteinase 2 in the rat denervated skeletal muscle at different time points
图注：与假手术组(正常)相比，a
P < 0.01。

表1 大鼠骨骼肌免疫组化染色后基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP-9蛋白阳性表达率
Table 1
The positive expression rates of matrix metalloproteinase 2 and 9 in the rat skeletal muscle detected by immunohistochemical staining 指标
假手术组(正常) 术后1 d 术后3 d 术后14 d 术后21 d 术后56 d 术后70 d χ2值
P 值 MMP-2
0 4% 30% 96% 42% 22% 6% 31.230 0.000 MMP-9 0
6%
42%
92%
36%
12%
2%
28.320
0.000
表3 大鼠坐骨神经切断后不同时间点肌肉中MMP-2，MMP-9, TIMP-1，TIMP-2 mRNA 表达的相关性分析
Table 3 Correlation analysis of the mRNA expression levels of matrix metalloproteinase 2 and 9 and tissue inhibitor of
metalloproteinase 1 and 2 in the rat denervated skeletal muscle at different time points
变量1 变量2 Spearman 相关系数 P 值 MMP-2 MMP-9 0.350 0.000 MMP-2 TIMP-1 0.423 0.002 MMP-2 TIMP-2 0.378 0.008 MMP-9 TIMP-1 0.377 0.003 MMP-9 TIMP-2 0.469 0.003 TIMP-1
TIMP-2
0.431
0.000
表2 大鼠坐骨神经切断后不同时间点肌肉中基质金属蛋白酶(MMP)2，
MMP-9 mRNA 表达变化 (x _
±s ，2
-∆∆Ct
)
Table 2 Changes in the mRNA expression levels of matrix
metalloproteinase 2 and 9 in the rat denervated skeletal muscle at different time points
坐骨神经损伤时间点 MMP-2 mRNA 的相对值 MMP-9 mRNA 的相对值 假手术组(正常) 1
1
1 d 0.45±0.10a 0.00±0.00a
2 d 0.58±0.08a
0.13±0.03a
3 d 2.28±0.32b 0.62±0.08b
4 d 1.69±0.25a 0.61±0.10a 7 d
1.34±0.19a 0.17±0.04a 14 d 1.44±0.25a 0.57±0.09a 21 d 1.80±0.28a 0.26±0.04a 28 d 1.55±0.27a 0.16±0.03a 42 d
1.54±0.18a 0.02±0.01a 56 d
2.13±0.28b 0.13±0.02a 70 d
0.58±0.14a
1.23±0.15b
表注：与假手术组(正常)相比，a P < 0.05，b P < 0.01。

表注：MMP ：基质金属蛋白酶；TIMP ：金属蛋白酶组织抑制因子。

Chen B, Liang J, Chen ZB. Expression and effects of matrix metalloproteinase 2 and 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and 2 in the denerved skeletal
muscle of rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(4):516-522. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0083
基质，N端域与MMPs的锌离子活性中心结合，C-末端域与MMPs的C-末端域相互作用，以1∶1的比例非共价键结合形成MMP-TIMP复合物，阻断MMP与底物结合，抑制MMP蛋白水解活性[4]，从而调节细胞外基质的分解代谢。

MMPs在肌肉的损伤和修复过程中有不同的表达形式，MMP-2与MMP-9主要参与骨骼肌的细胞外基质的重塑。

它们通过对细胞外基质的降解和对骨骼肌细胞的迁移、分化和重建在维持肌纤维功能的完整性方面发挥重要作用。

MMP-2，MMP-9主要降解非纤维胶原如作为基底膜主要胶原成分的Ⅳ型胶原和细胞外基质的其他成分，包括Ⅴ型胶原、纤维连接蛋白、弹力蛋白和层粘连蛋白。

它们与骨骼肌的发育、功能和病理过程相关，调节骨骼肌的细胞外基质的完整性和构成[5]，在成肌细胞的移行和融合中发挥重要的作用。

已证实正常小鼠体内有MMP-2，MMP-9的存在，MMP-2的激活和新的肌纤维再生相伴随，MMP-9的表达与炎性反应和肌卫星细胞的激活相关[6]。

MMPs和TIMPs在维持肌纤维和细胞外基质的稳定中有着重要的生理作用，在生理和病理的组织重塑期间MMPs/TIMPs之间的平衡调节细胞外基质的更新和重塑，在这些过程中两者都发挥着重要作用。

体外的实验证实MMPs和TIMPs在骨骼肌来源的成肌细胞的迁移和分化中起着重要作用[7-8]。

失神经支配后骨骼肌的发育和再生过程中，肌细胞的迁移和细胞外基质的重塑是重要的方面。

先前静止的肌原性的细胞，即肌卫星细胞被激活、增殖、分化，融合形成多核肌纤维。

肌卫星细胞是小的单核梭形细胞，是源于胚胎中胚层的干细胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维质膜之间，处于静止状态。

在肌细胞生成、肌肉重建和肌肉的其他适应性改变时增殖产生成肌前体细胞，并进一步分化、融合形成肌管参与骨骼肌的修复。

当骨骼肌失神经支配后，肌源性的卫星细胞被激活进入细胞循环。

肌卫星细胞融合形成肌纤维的过程中的一个关键步骤和金属蛋白酶密切相关。

这个过程依赖于从细胞外基质的一氧化氮制造和肝细胞生长因子的释放，肝细胞生长因子递呈于C-met受体，MMPs介导肝细胞生长因子从基质释放，这一步骤处于一氧化氮合成之后[9]。

肝细胞生长因子释放后与C-met受体结合，启动丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路和磷酯酰肌醇-3激酶通路，这两个通路诱导肌原性调节因子和其他的转录调节因子的转录和翻译是卫星细胞的激活和增殖所必需的[10]。

作者观察到失神经支配大鼠骨骼肌中MMP-2，9的变化，在早期肌纤维间隙紧密，肌束之间纤维成分较少，免疫组织化学技术不能检测到MMP-2，9表达，这时候二者仅仅存在于血管周围，这与Schoser等[11]发现一致，但是随着失神经支配过程的进展，肌纤维变性，肌纤维分离，间隙分开，MMP-2，MMP-9逐渐增加。

在神经损伤的早期(第3，4天)，由于炎性反应，中性粒细胞和巨噬细胞的增多，参与清除损伤组织，导致MMP-2，MMP-9分泌增多，MMP-2，MMP-9 mRNA含量与苏木精-伊红染色、Massion 染色中炎性细胞的浸润呈正相关。

随着炎性反应的减退，MMP-9在14 d后明显降低。

在参与去神经支配骨骼肌的再生和重建过程中，两者分布稍有区别。

MMP-9则主要集中在肌束膜，肌束间以及神经外膜，MMP-2主要集中在肌纤维膜，这与Kherif等[12]报道的主要存在于神经肌肉接头不同，与Demestre等[13]的发现一致。

这可能与肌纤维之间的基质分布以及两者的降解的底物不同而产生的差别。

当急性期过后，两者的含量又逐渐降低。

随着时间的延长，肌肉组织中的纤维基质含量逐渐增加，第21天后两者出现不同的趋势，MMP-2保持一个较高的水平，MMP-9呈现一个较低的水平。

MMP-2，9的表达和活性在肌肉不同的重建阶段而不同，这是因为MMP-2，MMP-9在肌肉重建的不同阶段发挥不同的作用。

MMP-2和MMP-9分别于骨骼肌去神经支配后的56 d 和70 d达到第2个高峰，这可能与肌卫星细胞在此时间段被激活达到最大值，以及肌纤维细胞的再生有关。

先前研究证实卫星细胞和成肌细胞能产生MMP-2，MMP-9，MMPs 能够降解细胞外基质的成分[14]，从而促进卫星细胞的移行和分化[15]。

Viguie等[16]应用电镜研究大鼠去神经支配趾长伸肌发现肌卫星细胞的数量在去神经支配后的2个月时增加至最大值，随后逐渐降低，推测卫星细胞池的持续下降可能是卫星细胞凋亡的结果。

Dedkov等[17]发现去神经支配后的25个月时骨骼肌中大多数新形成的肌纤维没有发育成为成熟的骨骼肌，只是形态上类似肌管的结构，新形成的肌纤维中没有发现肌卫星细胞存在，认为肌卫星细胞数量的减少甚至耗竭是造成去神经支配骨骼肌进行性萎缩的主要原因。

MMP-2和MMP-9出现第2个高峰的时间差异性可能与它们在去神经支配肌肉中参与组织重塑的不同方面有关。

体外的实验证实，在缺乏MMP-2、MT1-MMP的情况下培养的胚胎细胞不能有效地形成肌管，证明MMP-2、MT1-MMP是肌管形成的主要因素，在成肌细胞的迁移中发挥重要作用[18]。

MMP-9失活导致肌纤维的大小和类型的变化[19]。

MMP-2的激活和新的肌纤维再生相伴随，MMP-9的表达与炎性反应和肌卫星细胞的激活相关[20]。

与MMP-2，9类似，TIMP-1，2 mRNA水平也于神经横断后的第3天出现10倍于正常肌肉的升高。

但此后TIMP-1，2出现分化，自神经横断后的第4-70天TIMP-1 mRNA水平显著下降至正常水平，没有第2个高峰的出现；TIMP-2 mRNA水平自神经横断后的第4-42天逐渐下降至正常水平，然而在56 d增高至正常肌肉的12倍水平。

TIMP-1和TIMP-2的表达增高表明它们参与失神经骨骼肌退变的早期阶段，TIMP-2也参与失神经骨骼肌退变的后期阶段，而TIMP-1并不参与。

这些结果可能表明TIMP-2表达的增长和失神经骨骼肌退变的关联。

TIMPs以1∶1的比例共价结合于MMPs抑制其活性从而达到平衡，MMPs和TIMPs的比值在一定程度上反映总体的蛋白水解活性，MMPs和TIMPs。