羟丁基壳聚糖CD133+抗体温敏膜对人脐静脉内皮细胞生长的影响

羟丁基壳聚糖CD133+抗体温敏膜对人脐静脉内皮细胞生长
的影响
张学丽;李健;李丹;刘相萍;安毅
【摘要】目的观察复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及血液相容性的影响.方法将HUVEC接种于裸钴铬合金片膜(裸金属支架组)、雷帕霉素药物涂层钴铬合金片膜(雷帕霉素支架组)、复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜钴铬合金片膜(抗温敏膜组).培养24h后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态;以MTT比色法检测细胞增殖活性,划痕试验检测细胞的迁移能力,ELISA检测各组细胞上清液中内皮素-1(ET-1)、降钙素基因相关肽(CGRP)、前列环素代谢物6-酮-前列腺素F1α(PGF1α)水平.结果HUVEC在抗温敏膜上生长良好,形态正常.与裸金属支架组、雷帕霉素支架组相比,在抗温敏膜组存活的HUVEC数目增高(P均＜0.05).HUVEC在抗温敏膜组上迁移率高于裸金属支架组、雷帕霉素支架组(P均＜0.05).与裸金属支架组、雷帕霉素支架组相比,抗温敏膜组细胞分泌的ET-1水平降低;CGRP、PGF1α水平升高(P均＜0.05).结论复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜有助于HUVEC的增殖和迁移,对HUVEC的血液相容性良好.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2014(054)001
【总页数】4页(P1-3,17)
【关键词】人脐静脉内皮细胞;壳聚糖;CD133+;内皮素-1;降钙素基因相关肽;前列环素代谢物6-酮-前列腺素F1α
【作者】张学丽;李健;李丹;刘相萍;安毅
【作者单位】青岛大学医学院附属医院,山东青岛266000;青岛大学医学院附属医院,山东青岛266000;青岛大学医学院附属医院,山东青岛266000;青岛大学医学院
附属医院,山东青岛266000;青岛大学医学院附属医院,山东青岛266000
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2;R541.4
支架在置入过程中会损伤内皮细胞，引起血小板聚集及血栓形成，且药物涂层支架局部释放的药物，在抑制平滑肌细胞增生的同时也抑制了损伤内皮的修复，导致支架内再狭窄及血栓形成。

壳聚糖能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，而且具有良好的血液相容性和抗动脉粥样硬化作用［1～3］。

能够捕获外周血中的多潜能干
细胞使其分化为内皮细胞，快速增殖替代受损的内皮细胞，使支架表面迅速内皮化来阻止内膜增生和防止血栓形成。

本课题组的前期研究采用猪髂动脉内皮细胞进行离体实验，表明复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载抗体温敏膜能够促进猪髂动脉内皮细胞的生长［4］。

2011年1月～2013年12月，我们在此基础上采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，进一步研究复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载抗体温敏膜对HUVEC增殖、迁移和血液相容性的影响［5］。

1 材料与方法
1.1 材料高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(购自Hyclone公司)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(购自美国Sigma公司)，内皮素-1(ET-1)-ELISA试剂盒、降
钙素基因相关肽(CGRP)-ELISA试剂盒、前列环素代谢物 6-酮-前列腺素F1α (PGF1α)-ELISA试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司)，HUVEC(购自ATCC公
司)。

钴铬合金片膜及雷帕霉素药物涂层钴铬合金片膜由上海微创公司制备，复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载抗体温敏膜由中国海洋大学制备。

1.2 方法
1.2.1 HUVEC培养 HUVEC采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37.0℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养，长至80%融合时传代。

细胞传代时，弃去原培养液，PBS漂洗2次，胰蛋白酶消化3～5 min，加入1～2 mL培养基终止消化，然后分瓶传代培养。

传代后，每天观察细胞状态，隔天换液，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组本实验分为裸钴铬合金片膜(裸金属支架组)、雷帕霉素药物涂层钴铬合金片膜(雷帕霉素支架组)、复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载抗体温敏膜钴铬合金片膜(抗温敏膜组)。

1.2.3 HUVEC增殖检测采用MTT法，取对数生长期的HUVEC分别接种到放有3种不同支架的培养瓶中，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24 h，PBS洗涤2次，胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液配成单细胞悬液、计数。

无菌条件下按5.0×103/mL浓度的细胞悬液接种于3个96孔培养板，每孔加细胞悬液100 μL置于37.0℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养，分别培养24、48、72 h。

显色，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续在培养箱中孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内的培养液。

每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，溶解结晶物。

选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值(D490)，空白对照调零，记录结果。

以上实验重复3次，取其平均值。

每组20份标本，即做20个平行孔。

1.2.4 细胞迁移能力检测采用划痕试验，分组同上，取各组对数生长期的细胞
1×106个接种于6孔板中，置37.0℃、5%CO2饱和湿度孵箱中孵育24 h，在单细胞表面用10 μL枪头垂直划过并制造多条相互平行的划痕，力度以刮落细胞而
不在培养板上留痕为准，PBS清洗3次后加入无血清培养基继续培养24 h，10×
倒置相差显微镜下观察划痕中细胞迁移情况并拍照，采用Image J软件对图像进
行分析处理。

以上实验重复3次，取其平均值。

1.2.5 细胞因子检测各组细胞培养24 h后，取各组离心后上清液按ELISA试剂盒说明书操作，测各组ET-1、CGRP、PGF1α水平。

上述实验重复3次，取其平均值。

每组12份标本，即做12个平行孔。

1.2.6 统计学方法采用SPSS17.0统计软件，计量资料以s表示，组间比较采用两独立样本t检验。

P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 雷帕霉素支架组和抗温敏膜组HUVEC增殖镜下表现倒置相差显微镜下可见雷帕霉素支架组和抗温敏组HUVEC生长致密，贴壁正常，呈多角形，如铺路石样，胞体上突起向四周伸展，与裸金属支架组相比无明显增大或缩小。

2.2 三组细胞不同生长时间D490比较HUVEC在裸金属支架组、雷帕霉素支架组、抗温敏膜组分别生长24、48、72 h的D490见表1。

与裸金属支架组、雷帕霉素支架组相比，抗温敏组存活HUVEC数目增加(P均＜0.05)。

2.3 三组细胞的迁移能力比较 24 h后显微镜下观察并通过ImageJ软件进行图像
处理。

由(初始宽度—终末宽度)/初始宽度计算得知抗温敏组细胞迁移率为
(99.53±0.24)%，雷帕霉素组细胞迁移率为(88.69±0.96)%，裸金属支架组细胞迁移率为(92.25±1.71)%，抗温敏组与雷帕霉素组、裸金属支架组相比有统计学差异(P均＜0.05)。

表1 三组不同生长时间D490比较(s)注:与裸金属支架组比较，aP＜0.05;与雷帕霉素支架组比较，bP＜0.05D组别 n 490 24 h 48 h 72 h裸金属支架组20
0.897±0.062 1.265±0.108 1.426±0.058雷帕霉素支架组 20
0.649±0.057a1.011±0.105a 1.278±0.048a抗温敏组 20
1.305±0.162b1.602±0.048b
2.062±0.046b
2.4 三组细胞因子水平比较 24 h后，与裸金属支架、雷帕霉素支架组相比，抗温
敏膜组ET-1水平降低，CGRP、PGF1α水平增高(P均＜0.05)。

见表2。

表2 三组细胞因子水平比较(ng/L，s)注:与裸金属支架组比较，cP＜0.05;与雷帕
霉素支架组比较，dP＜0.05组别 n ET-1 CGRP PGF1α 12 70.95±1.46
21.57±0.91 18.63±1.03雷帕霉素支架组 12
63.21±3.43c18.80±0.75c16.87±0.35c抗温敏组 12
44.43±1.86d27.43±1.06d23.45±0.59裸金属支架组d
3 讨论
壳聚糖是一种天然聚阳离子生物多糖，降解产物为D-氨基葡萄糖，与细胞外基质
中蛋白多糖分子链结构相似，可被人体吸收，是组织工程最常用的基材之一;能支
撑血管内皮细胞、心脏瓣膜内皮细胞和皮肤真皮成纤维细胞在其表面的生长，具有良好的生物相容性和生物可降解性，已被广泛应用于生物医学领域［6］。

相关内皮细胞在心血管植入物表面形成类似天然血管的内膜组织，即体内内皮化，是最终解决支架置入后血栓形成、内膜增生和再狭窄的方法。

是一种5次跨膜细胞表面
分子，是一类早期抗原，只在骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表达，在成熟内皮细胞上不表达［7］。

将抗体包被于支架表面，通过抗原—抗体反应，捕获循环血液中的内皮祖细胞，使其附着在支架表面并分化为内皮细胞，以此来加速支架表面的内皮化。

本课题组前期研究表明，抗温敏膜能够促进血管内皮细胞的增殖，使VEGF表达
增多，PDGF表达减少。

本实验在此基础上又研究了ET-1、CGRP、PGF1α的表达。

ET-1是强烈的缩血管物质，可以促进血管平滑肌的增殖，促进血栓形成，是
反映血管内皮功能的重要指标。

CGRP是目前已知体内最强的舒血管活性肽，对冠状动脉及外周血管均有扩张作用，对体外及体内心肌具有正性变力、正性变时作用。

CGRP抑制平滑肌细胞的增殖可能是通过抑制周期蛋白D、E的积累，使血管平滑肌细胞停止于G0/G1期，限制细胞周期的进程［8］。

CGRP同时可以促进血管
内皮细胞的增生、加速血管内皮化、抑制脂质过氧化、抗动脉硬化，对缺血心肌有保护作用［9］。

PGF1α是前列环素(PGI2)的稳定代谢产物，PGI2是内皮细胞中
花生四烯酸的代谢产物，具有很强的扩张血管、抑制平滑肌增殖和血小板聚集、抗栓、抑制炎性介质释放、抗重构的作用。

其舒张血管的作用机制是通过cAMP途
径阻断钙离子内流［10］;其抗血小板作用是PGI2和血小板膜上的特异受体结合，刺激腺苷酸环化酶，使血小板内cAMP水平增高，从而抑制血小板形态改变、血
小板聚集和释放，并抑制因子Ⅷ、vWF、纤维蛋白原与血小板膜上特异受体结合，以及抑制血小板的促凝活性。

细胞增殖是刺激细胞增殖的外界信号作用于细胞受体后产生的一种以细胞周期改变为主的综合性细胞行为，细胞周期时相的改变是推动细胞增殖的重要原因［11］。

各种细胞在材料表面的黏附过程包括两个阶段:即材料对细胞的非特异性吸附和细
胞向材料表面的特异性吸附。

本结果表明，HUVEC在抗温敏膜上生长良好，形态正常，细胞伸出伪足于聚合物表面。

这是因为壳聚糖具有良好的亲水性和带有大量正电荷，使HUVEC向材料表面的非特异性吸附增加，促进了细胞的黏附和生长。

培养24 h，抗温敏组HUVEC迁移率显著高于裸金属支架组及雷帕霉素支架组，
抗温敏组ET-1水平明显降低，CGRP及PGF1α水平显著升高，表明抗温敏组能
够促进HUVEC分泌CGRP及PGF1α，促进内皮细胞的生长。

进一步证实了复合
羟丁基壳聚糖纳米载体携载抗体温敏膜能够促进损伤内皮的快速修复，使支架再内皮化，从而防止支架内再狭窄及血栓形成。

抗温敏膜支架在离体及在体实验中的可行性及安全性必将为今后新型支架的临床实验提供更多依据。

但是，本研究也存在一些问题，如内皮祖细胞具有多向分化潜能，能否按预期分化为内皮细胞，分化而来的内皮细胞是否具有成熟内皮细胞的生理功能以及远期临床效果如何，尚需要长
期大规模随机、对照研究加以验证。

参考文献:
【相关文献】
［1］刘宗军，孟晟，秦永文，等.壳聚糖和磷脂化壳聚糖涂层膜对血管内皮细胞生长和血液相容性的影响［J］.第二军医大学学报，2007，28(1):19-22.
［2］Meng S，Liu ZJ，Zhong W，et al.Phosphoryl-cholinemodified chitosan:appetent and safe material for cells［J］.Carbohydrate Polymers，2007，70(1):82-88.
［3］杨军珂，吴宗贵，郭延松，等.壳聚糖对大鼠动脉粥样硬化的影响及其机制探索［J］.心血管康复医学杂志，2007，16(5): 488-492.
［4］刘雯，李健，安毅.复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载抗体温敏膜对猪髂动脉内皮细胞生长的影响［J］.心血管康复医学杂志，2012，21(1):18-20.
［5］Jaffe EA，Nachman RL，Becker CG，et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by mor phologic and immunologic criteria［J］.J Clin Invest，1973，52 (11):2745-2756.
［6］Chandy T，Sharma CP.Chitosan—as a biomaterial［J］.Biomat Artif Cells Artif Org，1999，18(1):1-24.
［7］Peichev M，Naiyer AJ，Pereira D，et al.Expression of VEGFR-2 and AC 133 by circulating human CD34 cells identifies a population of functional endothelial precursors ［J］.Blood，2000，95 (3):952-958.
［8］林洪.降钙素基因相关肽的表达调节及其心血管系统作用［J］.中外医疗，2009，28(13):157. ［9］Zheng S，Li WJ，Xu MJ，et al.Calcitonin gene-related peptide promotes angiogenesis via AMP-activated protein kinase［J］.Am J Physiol，2010，299(6):1485-1492.
［10］Kawabe J，Ushikubi F，Hasebe N.Prostacyclin in vascular disease-recent insights and future perspectives［J］.Circ J，2010，74 (5):836-843.
［11］Jackson LN，Evers BM.Regulation of proliferatioin，apoptosis and cell cycle in gastro intestinal disorders［J］.Curr Opin Pharmacol，2009，9(6):708-714.。