第10章 分光光度法 分析化学
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应化13 分析化学
当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶 液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成 正比关系－－－朗伯比尔定律 －－－光吸收定律
数学表达：A＝lg(1/T)=Kbc
其中，A:吸光度，T:透射比，
K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度
注意： 平行单色光 均相介质 无发射、散射或光化学反应
第十章
分光光度法
10.1 概述
10.2 吸光光度法基本原理
10.3 分光光度计
10.4 显色反应及影响因素
10.5 光度分析法的设计 10.6 吸光光度法的误差 10.7 常用的吸光光度法 10.8 吸光光度法的应用
应化13 分析化学
10.1 概述
吸收光谱 发射光谱 散射光谱
分子光谱 原子光谱
控制浓度 吸光度A：0.2～0.8
减少测量误差
应化13 分析化学
3 参比溶液选择
仪器调零 消除吸收池壁和溶液对入射光的反射
扣除干扰
试剂空白 试样空白
褪色空白
应化13 分析化学
4 标准曲线制作 理论基础：朗伯-比尔定律
相同条件下
0.35
0.30
测定不同浓度标准
溶液的吸光度A A～c 作图
A
0.25
b 生色团和助色团 生色团: 含有π→π*跃迁的不饱和基团 助色团: 含非键电子的杂原子基团,如-NH2, -OH, -CH3… 与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强
应化13 分析化学
2 物质颜色和其吸收光关系 互补色
吸收光
物质的颜色 黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红 波长范围( l ,nm) 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
HOOC COOH NH
COOH HOOC HOOC COOH
- + H+ + VO3
N
N
+ VO + H2 O
2+
应化13 分析化学
离子缔合反应
(C2 H )N 52 O
C COOH + N (C2 H ) 52 H
.
AuCl4-
成盐反应
N HS C S C C O CH N (CH3 ) 2 N C C S O CH N (CH3 ) 2
A1 = e1bc1 A2 = e2bc2 A = e1bc1+ e2bc2
根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化 学反应平衡常数的测定
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10.3 吸光光度计
1 分光光度计的组成
读出系统
光源
单色器
样品池
检测器
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常用光源
光源 氢灯 波长范围(nm) 185~375 适用于 紫外
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Байду номын сангаас 2.双波长吸光光度法
目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰 多组分同时检测 原理： A = Al1-Al2 = （el1- el2）b c 波长对的选择： a.等吸光度点法，b.系数倍率法
3.导数吸光光度法
应化13 分析化学
例,苯酚与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中 苯酚(x)的双波长分光光度法测定。
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10.5 光度分析法的设计
1. 选择显色反应 2. 选择显色剂 3. 优化显色反应条件
4. 选择检测波长
5. 选择合适的浓度 6. 选择参比溶液 7. 建立标准曲线
测量条件选择
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1 测定波长选择
选择原则：“吸收最大，干扰最小” 灵敏度 选择性
应化13 分析化学
2 测定浓度控制
形式 H4L+ H3L H2LHL2pH 1.2 4.8-5.2 8.4-9.0 11.4-12.0 λmax(nm) 462-465 462,490 512 532-538 形式 Sn4+ Ga3+ pH 1.0 5.0 λmax(nm) 530 550
pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响
影响待测离子的存在状态，防止沉淀 影响络合物组成
选l1为参比波长, l2为测量波长 得
Al1= e xl1bcx + e yl1bcy Al2= e xl2bcx+ e yl2bcy ΔA=Al2-Al1= (e xλ2bcx+e yl2bcy)-(e xl1bcx+e yl1bcy)
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灵敏度表示方法
摩尔吸光系数 e
c: mol/L c: g/L
A = e bc A = abc a: 吸光系数
A = Kbc
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。
单位： (L•mol-1 •cm-1)
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桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所能 检测到的吸光物质的最低含量。 单位：mg/cm2 S=M/e
+ Ag+
AgS
C
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褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸
吸附显色反应 达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色
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3 显色剂
无机显色剂:
过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾 有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂III
AsO3 H2
N N HO3S OH OH H2 O3 As N N SO3H
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2 物理化学因素 非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测
吸光度增加，导致线性关系上弯
化学反应 离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42PAR的偶氮－醌腙式
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3 吸光度测量的误差 吸光度标尺刻度不均匀
dc/c= dA/A=dT/TlnT
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b 显色剂的用量 稍过量，处于平台区
c 显色反应时间 针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定
d 显色反应温度
加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解
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e 溶剂 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率 f 干扰离子 消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比 褪色空白(铬天菁S测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长
要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (ε>104) c. 产物的化学组成稳定 d. 化学性质稳定 e. 反应和产物有明显的颜色差别 (l>60nm)
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2 显色反应类型 络合反应
O OH As O M
N N HO3S
O
OH H2 O3 As N N SO3H
N
N Fe2+
3
氧化还原反应
应化13 分析化学
例：硫脲还原－硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸 溶，硫酸－高氯酸介质中，硫脲还原铁（III）为铁 (II),除干扰，还原钼（VI）为五价，2.00mg/100ml的 钼标准溶液为参比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的钼标 准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光 度,480nm测定A。
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4 朗伯-比尔定律
光吸收定律－朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律 吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律
I0 = I r + I t + I a I0 = I t + I a
I0 Ir Ia
It
T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg (I0 / It )＝lg(1/T), A:吸光度 朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比 比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8
concentration
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10.6 吸光光度法的误差
对朗伯-比尔定律的偏移 非单色光引起的偏移 物理化学因素：非均匀介质及化学反应 吸光度测量的误差
应化13 分析化学
1 非单色光引起的偏移 复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b, 引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引 起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。
氘灯
钨灯 卤钨灯 氙灯 能斯特灯 空心阴极灯 激光光源
185~400
320~2500 250~2000 180~1000 1000~3500 特有 特有
紫外
可见，近红外 紫外，可见，近红外 紫外、可见（荧光） 红外 原子光谱 各种谱学手段
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单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅
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10.7 常用的吸光光度法
1.示差吸光光度法 目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高(低)浓度组分(i.e. A在0.2~0.8以外)问题 分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法 特点： 以标准溶液作空白 原理： A相对 = A = ebcx- ebc0= eb c 准确度：读数标尺扩展, 相对误差减少, c0愈接近cx, 准确度提高愈显著
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三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料 铬天菁S
COOH HO CH3 Cl C Cl SO3H COOH O CH3
三苯甲烷碱性染料 结晶紫
(H3C)2N C N(CH3)2
N(CH3)2
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邻菲罗啉类：新亚铜灵
N CH3
N CH3
肟类：丁二肟
CH 3 HO C N C N CH 3 OH
Er=dc/c×100％= dA/A×100％=dT/TlnT×100％
A＝0.434 ，T＝36. 8% 时，测量的相对误差最小 A=0.2~0.8, T=15~65%，相对误差<4%
应化13 分析化学
令ST=0.01,计算T不同值时的Sc/c，当TlnT对T进行 微分时，其值为零时，Sc/c最小，此时T=0.368。
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3 一些基本名词和概念
吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小
A～l关系 最大吸收波长 lmax：光吸收最大处的波长
Δl 对比度(Δl):络合物最大吸 收波长(lMRmax)与试剂最大 吸收波(lRmax)之差
lmax
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原子光谱为线光谱
分子光谱为带光谱
电子跃迁能级 分子振动能级 分子转动能级
当光子的能量与分子的E匹配时， 远紫外光 近紫外光 就会吸收光子
E=hu=hc/l
可见光 近红外光 中红外光 远红外光
微波
无线电波
0.1~100cm
1～1000m
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有机化合物的生色原理
a 跃迁类型 价电子跃迁：σ→σ*, π→π*; n→σ*, n→π* E (hn) 顺序: n→π*<π→π*< n→σ*<σ→σ*
应化13 分析化学
4 多元络合物
混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O
离子缔合物 AuCl4--罗丹明B
金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB
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5 影响因素 a 溶液酸度（pH值及缓冲溶液）
影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl
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目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计
分光光度法与分光光度计
722型分光光度计光学系统图
1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜 4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管
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10.4 显色反应及影响因素
1 显色反应 没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量 生成有色化合物再测定－－ 显色反应
吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光 度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁
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10.2 吸光光度法基本原理
1 吸收光谱产生的原因 光:一种电磁波,波粒二象性
光谱名称
波长范围
X射线
0.1~10nm
10~200nm 200~400nm 400~750nm 0.75~2.5um 2.5~5.0um 5.0~1000um
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氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm 测定光吸收，A＝0.43,求S. (Nb原子量92.91)。 有两种做法：根据A=εbC,求ε
＝3.3×104 L· mol-1· cm-1
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吸光度的加和性
在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收 的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各 个吸光物质的吸光度之和
样品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
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检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶 液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成 正比关系－－－朗伯比尔定律 －－－光吸收定律
数学表达：A＝lg(1/T)=Kbc
其中，A:吸光度，T:透射比，
K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度
注意： 平行单色光 均相介质 无发射、散射或光化学反应
第十章
分光光度法
10.1 概述
10.2 吸光光度法基本原理
10.3 分光光度计
10.4 显色反应及影响因素
10.5 光度分析法的设计 10.6 吸光光度法的误差 10.7 常用的吸光光度法 10.8 吸光光度法的应用
应化13 分析化学
10.1 概述
吸收光谱 发射光谱 散射光谱
分子光谱 原子光谱
控制浓度 吸光度A：0.2～0.8
减少测量误差
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3 参比溶液选择
仪器调零 消除吸收池壁和溶液对入射光的反射
扣除干扰
试剂空白 试样空白
褪色空白
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4 标准曲线制作 理论基础：朗伯-比尔定律
相同条件下
0.35
0.30
测定不同浓度标准
溶液的吸光度A A～c 作图
A
0.25
b 生色团和助色团 生色团: 含有π→π*跃迁的不饱和基团 助色团: 含非键电子的杂原子基团,如-NH2, -OH, -CH3… 与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强
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2 物质颜色和其吸收光关系 互补色
吸收光
物质的颜色 黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红 波长范围( l ,nm) 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
HOOC COOH NH
COOH HOOC HOOC COOH
- + H+ + VO3
N
N
+ VO + H2 O
2+
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离子缔合反应
(C2 H )N 52 O
C COOH + N (C2 H ) 52 H
.
AuCl4-
成盐反应
N HS C S C C O CH N (CH3 ) 2 N C C S O CH N (CH3 ) 2
A1 = e1bc1 A2 = e2bc2 A = e1bc1+ e2bc2
根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化 学反应平衡常数的测定
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10.3 吸光光度计
1 分光光度计的组成
读出系统
光源
单色器
样品池
检测器
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常用光源
光源 氢灯 波长范围(nm) 185~375 适用于 紫外
应化13 分析化学
Байду номын сангаас 2.双波长吸光光度法
目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰 多组分同时检测 原理： A = Al1-Al2 = （el1- el2）b c 波长对的选择： a.等吸光度点法，b.系数倍率法
3.导数吸光光度法
应化13 分析化学
例,苯酚与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中 苯酚(x)的双波长分光光度法测定。
应化13 分析化学
10.5 光度分析法的设计
1. 选择显色反应 2. 选择显色剂 3. 优化显色反应条件
4. 选择检测波长
5. 选择合适的浓度 6. 选择参比溶液 7. 建立标准曲线
测量条件选择
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1 测定波长选择
选择原则：“吸收最大，干扰最小” 灵敏度 选择性
应化13 分析化学
2 测定浓度控制
形式 H4L+ H3L H2LHL2pH 1.2 4.8-5.2 8.4-9.0 11.4-12.0 λmax(nm) 462-465 462,490 512 532-538 形式 Sn4+ Ga3+ pH 1.0 5.0 λmax(nm) 530 550
pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响
影响待测离子的存在状态，防止沉淀 影响络合物组成
选l1为参比波长, l2为测量波长 得
Al1= e xl1bcx + e yl1bcy Al2= e xl2bcx+ e yl2bcy ΔA=Al2-Al1= (e xλ2bcx+e yl2bcy)-(e xl1bcx+e yl1bcy)
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灵敏度表示方法
摩尔吸光系数 e
c: mol/L c: g/L
A = e bc A = abc a: 吸光系数
A = Kbc
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。
单位： (L•mol-1 •cm-1)
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桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所能 检测到的吸光物质的最低含量。 单位：mg/cm2 S=M/e
+ Ag+
AgS
C
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褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸
吸附显色反应 达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色
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3 显色剂
无机显色剂:
过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾 有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂III
AsO3 H2
N N HO3S OH OH H2 O3 As N N SO3H
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2 物理化学因素 非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测
吸光度增加，导致线性关系上弯
化学反应 离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42PAR的偶氮－醌腙式
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3 吸光度测量的误差 吸光度标尺刻度不均匀
dc/c= dA/A=dT/TlnT
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b 显色剂的用量 稍过量，处于平台区
c 显色反应时间 针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定
d 显色反应温度
加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解
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e 溶剂 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率 f 干扰离子 消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比 褪色空白(铬天菁S测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长
要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (ε>104) c. 产物的化学组成稳定 d. 化学性质稳定 e. 反应和产物有明显的颜色差别 (l>60nm)
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2 显色反应类型 络合反应
O OH As O M
N N HO3S
O
OH H2 O3 As N N SO3H
N
N Fe2+
3
氧化还原反应
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例：硫脲还原－硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸 溶，硫酸－高氯酸介质中，硫脲还原铁（III）为铁 (II),除干扰，还原钼（VI）为五价，2.00mg/100ml的 钼标准溶液为参比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的钼标 准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光 度,480nm测定A。
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4 朗伯-比尔定律
光吸收定律－朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律 吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律
I0 = I r + I t + I a I0 = I t + I a
I0 Ir Ia
It
T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg (I0 / It )＝lg(1/T), A:吸光度 朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比 比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8
concentration
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10.6 吸光光度法的误差
对朗伯-比尔定律的偏移 非单色光引起的偏移 物理化学因素：非均匀介质及化学反应 吸光度测量的误差
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1 非单色光引起的偏移 复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b, 引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引 起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。
氘灯
钨灯 卤钨灯 氙灯 能斯特灯 空心阴极灯 激光光源
185~400
320~2500 250~2000 180~1000 1000~3500 特有 特有
紫外
可见，近红外 紫外，可见，近红外 紫外、可见（荧光） 红外 原子光谱 各种谱学手段
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单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅
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10.7 常用的吸光光度法
1.示差吸光光度法 目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高(低)浓度组分(i.e. A在0.2~0.8以外)问题 分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法 特点： 以标准溶液作空白 原理： A相对 = A = ebcx- ebc0= eb c 准确度：读数标尺扩展, 相对误差减少, c0愈接近cx, 准确度提高愈显著
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三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料 铬天菁S
COOH HO CH3 Cl C Cl SO3H COOH O CH3
三苯甲烷碱性染料 结晶紫
(H3C)2N C N(CH3)2
N(CH3)2
应化13 分析化学
邻菲罗啉类：新亚铜灵
N CH3
N CH3
肟类：丁二肟
CH 3 HO C N C N CH 3 OH
Er=dc/c×100％= dA/A×100％=dT/TlnT×100％
A＝0.434 ，T＝36. 8% 时，测量的相对误差最小 A=0.2~0.8, T=15~65%，相对误差<4%
应化13 分析化学
令ST=0.01,计算T不同值时的Sc/c，当TlnT对T进行 微分时，其值为零时，Sc/c最小，此时T=0.368。
应化13 分析化学
3 一些基本名词和概念
吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小
A～l关系 最大吸收波长 lmax：光吸收最大处的波长
Δl 对比度(Δl):络合物最大吸 收波长(lMRmax)与试剂最大 吸收波(lRmax)之差
lmax
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原子光谱为线光谱
分子光谱为带光谱
电子跃迁能级 分子振动能级 分子转动能级
当光子的能量与分子的E匹配时， 远紫外光 近紫外光 就会吸收光子
E=hu=hc/l
可见光 近红外光 中红外光 远红外光
微波
无线电波
0.1~100cm
1～1000m
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有机化合物的生色原理
a 跃迁类型 价电子跃迁：σ→σ*, π→π*; n→σ*, n→π* E (hn) 顺序: n→π*<π→π*< n→σ*<σ→σ*
应化13 分析化学
4 多元络合物
混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O
离子缔合物 AuCl4--罗丹明B
金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB
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5 影响因素 a 溶液酸度（pH值及缓冲溶液）
影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl
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目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计
分光光度法与分光光度计
722型分光光度计光学系统图
1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜 4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管
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10.4 显色反应及影响因素
1 显色反应 没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量 生成有色化合物再测定－－ 显色反应
吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光 度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁
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10.2 吸光光度法基本原理
1 吸收光谱产生的原因 光:一种电磁波,波粒二象性
光谱名称
波长范围
X射线
0.1~10nm
10~200nm 200~400nm 400~750nm 0.75~2.5um 2.5~5.0um 5.0~1000um
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氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm 测定光吸收，A＝0.43,求S. (Nb原子量92.91)。 有两种做法：根据A=εbC,求ε
＝3.3×104 L· mol-1· cm-1
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吸光度的加和性
在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收 的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各 个吸光物质的吸光度之和
样品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
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检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长