藜芦活性物质的提取及其抑菌效果研究

藜芦活性物质的提取及其抑菌效果研究
田慧霞;成莉;薛文娟;高斌;张椰莉;郭生金
【摘要】利用固液萃取技术从藜芦中提取活性物质,经分离纯化后,分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌进行抑菌试验.结果表明,藜芦活性物质对上述3种细菌的生长均有一定的抑制作用,不同浓度的活性物质的抑菌效果不同,并且提取物
浓度大小与抑菌效果呈正相关.其中,藜芦提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用最大,当提取物质量浓度为0.38～ 0.48 g/mL时,抑菌圈直径在18～23 mm之间.试验通
过对藜芦活性物质抑菌作用的测定,为扩大药源、合理开发和利用藜芦属植物资源
提供了借鉴和依据.%The active materials from Veratrum nigrum L. were extracted by extraction technology. After isolation and purification, the antibacterial experiment was tested with Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis respectively. The results showed that the active materials had remarkable inhibitory effects on growths of the three bacterial above mentioned, and the inhibitory effects changed following with the concentrations of the active materials. In addition, the concentration of active materials and the inhibitory effects showed a positive correlationship, and the inhibitory effects on Bacillus subtilis were greatly significant. The diameter of inhibition zone was 18 ~ 23 mm when the concentration of active materials was at 0.38 - 0.48 g/mL. Moreover
the determination of inhibitory effects of active materials against bacteria would provide reference and basis for expanding medicinal herbs resource, as well as reasonabld exploitation and utilization of the Veratrum plants.
【期刊名称】《山西农业科学》
【年(卷),期】2012(040)008
【总页数】4页(P866-869)
【关键词】藜芦;活性物质;抑制;细菌
【作者】田慧霞;成莉;薛文娟;高斌;张椰莉;郭生金
【作者单位】晋中学院生物科学与技术学院,山西晋中030600;晋中学院生物科学
与技术学院,山西晋中030600;晋中学院生物科学与技术学院,山西晋中030600;晋
中学院生物科学与技术学院,山西晋中030600;晋中学院生物科学与技术学院,山西
晋中030600;晋中学院生物科学与技术学院,山西晋中030600
【正文语种】中文
【中图分类】S482.2+92
藜芦（Veratrum nigrum L.）又称山葱，属于百合科（Liliaceae）藜芦属（Veratrum L.）多年生草本植物。

藜芦属植物约有40 余种，主要分布于亚、欧
和北美洲，在我国广泛分布于山西、河南、四川等地，生于海拔1 500～3 000 m 的山坡或山谷[1]。

该属多种植物可供药用，然而许多品种具有毒性，有的甚至具
大毒，具有抗真菌和杀死稻蝗[2]等农业害虫的能力。

藜芦味苦，性寒。

中医认为，藜芦有涌吐风痰、杀虫疗疮的功效，主要用于治疗高血压、中风、疟疾、骨折等疾病[3-4]。

藜芦全株有毒，毒素主要为藜芦甾体生物碱[5]，藜芦的中毒主要是急性中毒，如家畜食藜芦后半小时至数小时后出现大量流涎和持续呕吐、呻吟不安、腹胀、腹痛、腹泻、频频排尿，后期为全身衰竭、抽搐，瞳孔散大，血压和体温下降，
昏睡甚至昏迷，最后因呼吸衰竭而死。

因而，其被广泛应用于农业方面的杀虫、抑菌等研究[6]。

藜芦有抗真菌的作用，其水浸剂（1∶4）在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、铁锈色小芽胞癣菌、腹股沟表皮癣菌等皮肤真菌都有不同程度的抑制作用[5]。

藜
芦对结核菌也有较强抑制作用[7]，其乳膏有明显的体外杀螨作用[8]，并可治疗疥
疮[9]。

但是，关于藜芦中活性物质抑菌效果的研究较少。

本试验就藜芦活性物的提取及其抑菌效果进行初步研究，通过测定藜芦活性物质抑制细菌的作用，为其应用于新型植物源农药的开发提供依据。

1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试验材料藜芦（Veratrum nigrum L.）采自吕梁市庞泉沟，经查阅《中国
植物志》[10]鉴定其为黑藜芦。

1.1.2 主要仪器和器具脂肪提取器；250 mL圆底烧瓶；MH-500 型调温型电热套，北京科伟永兴仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有
限公司；DZKW-4 型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；HZS-H 型水浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；SB-JS-1 型洁净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GMSX-280 手提式压力蒸汽消毒器，北京市永光明
医疗仪器厂；DHX-9143B 型电热恒温鼓风干燥箱，上海福玛试验设备有限公司；培养皿；牛津杯（内径6 mm，外径8 mm）；移液管（1 mL）；涂布棒；注射器；酒精灯。

1.1.3 使用试剂 95%乙醇水溶液，2%H2SO4 溶液，石油醚，氨水，二氯甲烷（CH2Cl2）。

1.1.4 供试细菌大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）均由山西大学
生命科学院微生物实验室提供。

1.1.5 试验所用培养基和无菌生理盐水牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL，pH 值为7.2～7.4；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1 000 mL，pH值为7.2～7.4；无菌生理盐水为0.85 g NaCl 溶解于蒸馏水，再经高压
灭菌所制。

1.2 方法
1.2.1 藜芦活性物质的提取方法
1.2.1.1 藜芦活性物质的粗提取取藜芦根和茎，在恒温鼓风干燥箱中烘干，粉碎后，称量12 g包在预先准备好的滤纸包里，用200 mL 95%乙醇水溶液于100 ℃水
浴中热回流提取2.5 h。

1.2.1.2 藜芦活性物质的分离与纯化粗提取的藜芦成分由SHB-Ⅲ型循环水式多用
真空泵抽滤，去渣后，经减压蒸馏蒸出乙醇（0.07 MPa，40 ℃），浓缩成浸膏状物质。

然后用2%H2SO4 溶液酸化藜芦提取物（调pH 值至3.5），用石油醚进行脱色处理（脱色5～6 次），再用氨水调节脱色后的藜芦提取物pH 值至9～10，用二氯甲烷萃取出藜芦活性物质，最后再蒸馏出二氯甲烷（101 kPa，40～
50 ℃），得到纯化的藜芦活性物质。

1.2.2 藜芦活性物质对3 种细菌的抑菌试验
1.2.2.1 藜芦活性物质溶液的配制将经二氯甲烷萃取出的藜芦活性物质称质量后，再溶解于一定量的二氯甲烷（已知二氯甲烷无抑菌作用）中，并由二氯甲烷稀释成质量浓度分别为0.48，0.38，0.28，0.18，0.08，0.05 g/mL 的藜芦活性物质溶液，供抑菌试验用。

1.2.2.2 细菌的培养与接种预先制备牛肉膏蛋白胨固体、液体培养基和无菌生理盐水。

先将细菌接种到已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放置于恒温箱中37 ℃
下培养24 h。

然后将预先融化的无菌牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒入培养皿中（每皿盛12～15 mL 培养基），制成平板培养基。

再将3 种细菌于无菌生理盐水中稀释100 倍制成菌悬液，在无菌操作条件下，用涂布法接种到平板培养基中，供抑菌试验用。

1.2.2.3 藜芦活性物质抑菌试验取经灭菌的牛津杯放置于已接种3 种细菌的平板培养基中（每皿放置4 个牛津杯），用注射器量取由二氯甲烷稀释为不同浓度梯度的藜芦活性物质，并注射于牛津杯中（15 滴/ 杯），放置于恒温培养箱37 ℃下培养24 h 后，观察并测量抑菌圈大小。

每种浓度的藜芦活性物质分别对3 种细菌各进行3次抑菌试验，以蒸馏水为对照组。

2 结果与分析
2.1 抑菌圈大小
从图1 可以看出，藜芦活性物质在0.05～0.48 g/mL 范围内，对3 种细菌都有一定的抑制作用，而且抑菌作用随着藜芦活性物质浓度的增加而增大，其中，对枯草芽孢杆菌的抑制作用比较明显（图1-C）。

从表1 可以看出，藜芦活性物质的抑菌效果与其浓度呈正相关关系。

当藜芦活性物质的质量浓度为0.38～0.48 g/mL 时，藜芦活性物质的抑菌效果良好，抑菌圈直径在18～23 mm 之间。

以蒸馏水作为对照，所做的抑菌试验结果如图1-D所示。

结果表明，蒸馏水对细菌没有任何的抑制作用。

表1 藜芦活性物质对3种细菌的抑菌效果 mm藜芦质量浓度/（g/mL）0.48 0.38 0.28 0.18 0.08 0.05大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌抑菌圈直径18.9 19.0 19.3 18.7 19.1 19.5 16.5 17.4 15.9 12.0 12.0 11.0 8.0 8.2 8.1 8.0 8.0 8.0均值19.06均值19.50均值22.56 19.10 19.33 22.50 16.60 16.37 19.00 11.67 11.50 13.13 8.10 8.10 8.43 8.00抑菌圈直径20.0 19.3 19.2 20.0 20.0 19.0 17.5 15.6
16.0 12.0 11.5 11.0 8.0 8.1 8.2 8.0 8.0 8.0 8.00抑菌圈直径23.1 22.2 22.4 23.0 22.0 22.5 18.0 20.0 19.0 13.1 13.3 13.0 8.6 8.4 8.3 8.0 8.0 8.0 8.00
2.2 最小抑菌浓度
将藜芦活性物质稀释成更小浓度，采用牛津杯法，对3 种细菌进行抑菌试验，测定能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最小质量浓度。

结果表明，当藜芦活性物质的质量浓度小于0.08 g/mL时，对3 种细菌几乎没有抑制作用（图2）。

这说明能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最小质量浓度为0.08 g/mL。

3 结论与讨论
3.1 藜芦活性物质抑制细菌生长最小质量浓度
藜芦活性物质由二氯甲烷稀释到0.08 g/mL时，抑菌效果不明显；当质量浓度小于0.08 g/mL时，无抑菌效果，说明能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最小质量浓度为0.08 g/mL。

3.2 藜芦活性物质抑制细菌生长的最适浓度
藜芦活性物质由二氯甲烷稀释到0.38 g/mL时，抑菌效果较好；当质量浓度大于0.38 g/mL 时，抑菌圈大小基本无变化，说明能够抑制细菌生长的藜芦活性物质的最适质量浓度为0.38 g/mL。

3.3 藜芦活性物质可抑制细菌生长
一定浓度的藜芦活性物质对细菌有毒杀作用，能够抑制细菌生长。

参考文献：
［1］史志诚.中国草地重要有毒植物[M].北京：中国农业出版社，1997.
［2］任竹梅. 藜芦和苦参对中华稻蝗的毒力 [J]. 动物学报，2001，47（S1）：48-51.
［3］徐暾海，徐雅红.藜芦属植物化学成分和药理[J].国外医药：植物药分册，
2002，17（5）：185-189.
［4］徐国钧，徐珞珊，王峥涛.常用中药材品种整理和质量研究（第4 册）[M].福建：福建科学技术出版社，2001：121-178.
［5］赵瑜，陆国才.藜芦生物碱药理和毒理学研究进展[J].中药新药与临床药理，2008，19（3）：240-242.
［6］刘海峰.有毒植物提取的生物碱杀虫活性[J].安徽农业科学，2010，38（36）：20645-20648.
［7］毛晓峰，史志诚，王亚洲.我国藜芦属植物研究进展[J].动物毒物学，2003，18（1/2）：17-21.
［8］郑善子，崔春权，刘永镇.藜芦乳膏对毛囊蠕形螨的体外杀虫作用[J].延边大
学医学学报，2004，27（1）：31-32.
［9］杨素华，李东宁，孙健.藜芦乳膏治疗疥疮的疗效观察[J].辽宁中医杂志，2004，29（11）：664-666.
［10］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1980.。