02 病理学常用技术

免疫组化染色步骤
1. 脱蜡 – 组织经过处理后充满石蜡 – 传统方法是把切片浸泡在一系列的有机溶剂中清洗（二甲苯、柠檬 油精/取代物）
2. 再水化 – 去除有机溶剂，准备染色 – 在梯度酒精中再水化 • 2－3×100％酒精 • 95％酒精 • 70％酒精 –水
免疫组化染色步骤
3. 复染 – 蓝染 • 碱性溶液使组织的pH值增高，把色调由红色/蓝色变成紫色
一抗 病人组织
酶 显色剂
间接酶免疫组化
• 多步孵育 • 酶标记物连接到二抗上 • 加入适当显色剂和底物后即可显色
二抗
一抗 病人组织
酶 显色剂
免疫组化的显色 – 间接
H2O2
二抗
Primary antibody Patient tissue
DAB
酶
生物素 亲和素
酶和显色剂
• 辣根过氧化物酶 – Diaminobenzidine (DAB) – 产生栗棕色 – Aminoethylcarbazole (AEC) – 产生砖红色
• 碱性磷酸酶（AP） – Fast Red – 产生紫红色 – NBT – 产生深蓝色 – 一般用于原位杂交ISH (in situ hybridization)
怎样才是质量好的免疫组化染色？
• 高质量的免疫组化染色切片
– 足够强的染色信号，可以很好的区分 – 高灵敏度，高特异性，低背景 – 能显示形态学的特征 – 增强病理专家诊断的信心 – 病理专家阅片时不会感到疲劳和吃力 – 稳定性好
• 由于抗体分子不能直接被观察到，因此抗体结合位点也无法被观测到 • 为了使免疫反应可视化，需要为其连接上一个带有可见信号的小分子 • 这些分子能够通过直接或间接的方法连接到一抗上 • 常用的两种小分子为荧光素和酶
免疫组织化学（IHC）
• 结合了免疫学、组织学和X抗原)
切片上的组织
观察方法
也可指标记物或检测
IHC – 一抗
• 直接与靶抗原反应 – (抗原 = 能够引起免疫系统产生特异性免疫应答的外来物质)
• 可以是单克隆或多克隆 • 可以标记，也可以不标记
免疫组织化学
取材 切片
H&E
送检
大体观察
冰
冻
切
包埋
片
捞片
免疫组化染色步骤
• 免疫组化日常手工染色步骤
– 脱蜡 – 再水化 – 抗体染色 – 脱水 – 清洗 – 封片
免疫组化染色步骤
4. 脱水 – 去除残余染色和水分 – 梯度酒精漂洗（浓度逐渐升高） • 70％酒精 • 95％酒精 • 2～3次100％酒精
5. 清洗 – 去除酒精，准备封片 – 2～3次有机溶剂的漂洗
6. 封片 – 滴上封片剂（中性树胶） – 封上盖玻片
直接酶免疫组化
• 一步孵育 • 酶直接标记在一抗上 • 加入适当显色剂和底物就会显色
病理诊断技术
H&E – 苏木素－一红 两种不同颜色，判断组织细胞大小、形状 、排列结构； 信息有限；用于初步诊断
B/W aerial photo
SS – 特殊染色
使用不同染料、方法及化学程序. 对组织结构 与细胞成分地进一步认识
Color aerial photo
IHC – 免疫组织化学
抗体选择性与细胞内蛋白结合；可认识细胞 分类及来源；用于辅助肿瘤诊断
病理学常用染色技术
患者
切除，处理，切片，放在玻璃片上
IHC-DAB & RED IHC-DAB FITC
IHC/FITC (蛋白)
NexES-IHC, Benchmark, XT/LT
H&E
SS (细胞结构)
NexES-SS
ISH/FISH (DNA/RNA)
Benchmark, XT/LT
ISH FISH
怎样才是质量好的免疫组化染色？
• 病理专家阅片时感到 3 Cs
– Comfort
舒服
– Confidence 自信
– Consistency 稳定
We Innovate Healthcare
View factory
ISH – 原位杂交
DNA 和RNA: 细胞遗传物质； 用于认识基因 及基因表达
Bldg blueprint
正常 vs 癌 细胞
Jones Stain
淋巴组织 CD20
Her2 基因
IHC – 组织
• 组织切片 – 新鲜冰冻 – 固定并用石蜡包埋
• 细胞涂片 • 网状细胞
IHC – 成像系统