生物玻璃复合P-15多肽修复兔颅骨缺损的实验研究

·论著·
大体积骨缺损仍是医学尚未解决的重大难题之一。

自体骨移植仍被认为是修复骨缺损的“金标准”，然而其应用受到许多限制，如需开辟第二术区、手术时间长、引起供区损伤、可取骨量有限、植入后骨吸收等。

近年来，异质移植材料及人工合成材料的研究应用取得了很大进展。

已有许多生物活性蛋白与各类支架材料复合以提高人工骨替代材料成骨能力的文献报道[1⁃2]；但蛋白与支架材料的吸附与缓释，以及重组蛋白的成本及活性问题等限制了其临床应用。

而黏附肽类保留了相关蛋白中发挥生理作用的主要成分，参与了细胞生物力信号的传导，可促进细胞黏附、增殖、分化等，且空间构象相对固定，合成简单，P⁃15多肽就是其中的代表。

骨的有机成分中90％以上是由Ⅰ型胶原构成的，在其α1链上一段与间充质细胞结合且高度保守的15个氨基酸序列被称为P⁃15[3]。

其能与各种前体细胞上的整合素受体结合，促进细胞黏附，释放生成因子，协同促进成骨细胞前体细胞的分化。

携带P⁃15多肽的无机牛骨（PepGen P⁃15TM）在口腔上颌窦提升术[4]、牙周组织再生[5]，以及同富血小板纤维蛋白合用于骨再生[6]多有文献报道，显示了这种骨替代材料一定的优越性。

生物玻璃是通过美国食品药品监督管理局认证的人工骨材料，其与体液接触后经一系列化学反应，在材料表面形成富含硅的凝胶层，在此表面磷酸钙聚集晶化形成碳酸羟基磷灰石，胶原和一些黏多糖也被吸附，新生的骨质层可与生物玻璃紧密结合在一起[7]。

因此，本研究联合生物玻璃与P⁃15多肽各自的优点用于骨缺损动物模型的修复，为以仿生多肽为基础的生物材料
生物玻璃复合P⁃15多肽修复兔颅骨缺损的实验研究
王帅1，李成库2，周延民2（1.遵义医学院附属口腔医院科研科，贵州遵义563000；2.吉林大学口腔医学院，吉林长春130021）
【摘要】目的探讨生物玻璃复合P⁃15多肽对兔颅骨缺损的修复能力。

方法将骨髓基质细胞与复合不同质量浓度P⁃15多肽（100、200、400μg/mL）的生物玻璃（复合材料）进行体外培养（实验组），并以未复合P⁃15的生物玻璃作为阴性对照组；接种后1、3、7、10d检测骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性，筛选出多肽质量浓度最适宜的复合材料植入兔颅骨缺损内（复合材料组），植入后4、6、8周通过软X射线和组织学染色观察新骨形成情况。

结果P⁃15多肽质量浓度为200μg/mL时与生物玻璃共培养的骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性明显高于质量浓度为100、400μg/mL的实验组及阴性对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；4、6、8周时复合材料组兔颅骨缺损内新骨形成均优于同时间点阴性对照组。

结论生物玻璃复合P⁃15多肽可促进兔颅骨缺损的修复。

【关键词】骨髓基质细胞；细胞，培养的；生物玻璃；生物相容性材料；肽类；颅骨/外科学；动物，实验DOI：10.3969/j.issn.1009⁃5519.2018.19.008文献标识码：A文章编号：1009⁃5519（2018）19⁃2969⁃04
Experimental study on the repair of rabbit cranial bone defect by bioglass and peptide/P⁃15bone substitute material WANG Shuai1，LI Chengku2，ZHOU Yanmin2（1.Department of Scientific Research，Hospital of Stomatology，Zunyi Medical Uni⁃versity，Zunyi，Guizhou563000，China；2.School of Stomatology，Jilin University，Changchun，Jilin130021，China）【Abstract】Objective To investigate the effect of bioglass and peptide/P⁃15bone substitute material on the repair of rabbit cranial bone defect.Methods Bioglass was saturated with different concentrations of solution of the P⁃15peptide（100，200，400μg/mL）and cultured with bone marrow stromal cells in vitro（the experimental group）.Bioglass without P⁃15served as a negative control group.Then the alkaline phosphatase（ALP）activity of bone marrow stromal cells was detected at1，3，7，10d after inoculation to choose the composite materials with the optimum concentration of P⁃15to implant into the cranial bone defect of rabbit（composite group）.The quality and quantity of new bone formation was observe by X⁃ray and histology staining at4th，6th，8th week after implantation.Results At the concentration of200μg/mL of the P⁃15in phosphate buffered saline，the bone marrow stromal cells which were cultured with the Bioglass/P⁃15showed greater alkaline phosphatase（ALP）activity than that at the concentrations of100，400μg/mL in experimental group and the negative control group，and the difference had statistical significance（P<0.05）.The new bone formation of cranial bone defect of rabbit at4th，6th，8th week in the composite group was better than that in the negative group.Conclusion Bioglass/P⁃15bone substitute materials can accelerate the repair of rabbit cranial bone defect.
【Keywords】Bone marrow cells；Cells，cultured；Glass；Biocompatible materials；Peptides；Skull/surgery；Animals，laboratory
作者简介：王帅（1982—），博士研究生，讲师，主要从事干细胞、骨组织再生方面的研究
的研究提供理论和实验基础。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂P⁃15序列为GTPGPQGIAGQRGVV，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；高效液相色谱法分析其纯度为96.28%，质谱图报告结果相对分子质量为1393.58D。

生物玻璃购自北京国药前景公司，速眠新麻醉剂Ⅱ、陆醒宁通用名等由解放军军需大学提供，杜氏改良Eagle培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自奥地利PAA公司，碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2仪器二氧化碳恒温细胞培养箱（日本三洋公司）、超净工作台（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）、倒置显微镜（OLYMPUS CKX41型）、GIOTTO钼靶软X线机（意大利IMS公司）、石蜡切片机（德国Letiz 公司）、紫外分光光度仪U⁃2910（日本日立公司）等。

1.1.3实验材料选取Wistar大鼠10只（体重90.0～110.0g）、5月龄雄性日本大耳白兔18只（体重
2.1～2.8kg），由吉林大学动物中心提供。

1.2方法
1.2.1细胞获取与培养将Wistar大鼠采用速眠新麻醉剂Ⅱ进行局部麻醉，固定于木板上，放血处死。

完整取下股骨至足部，去皮，于75%乙醇内浸泡5min，全程保证大鼠骨骺段组织完整。

在超净工作台上小心拧下股骨远心端，暴露干骺端，用20mL注射器吸取约10mL 培养基，插入骨骺内抽取骨髓，边吸取边注入离心管内。

胫骨给予相同处理。

双下肢吸取完毕后用吹管吹打离心管内组织块，1000r/min离心5min，轻轻吹打离心管底部沉淀制成细胞悬液，移至100mm培养皿中，轻轻摇晃培养皿，使细胞及组织均匀分布，在倒置显微镜下观察细胞多层悬浮，置于37℃、含5%二氧化碳及饱和湿度细胞培养箱内。

48h后首次换液，去除血细胞及其他悬浮细胞。

视野内可见圆形细胞、梭形多角细胞集簇分布。

以后3d更换1次培养液。

每天用倒置显微镜观察细胞生长状况和形态变化。

待细胞生长汇合达80%以上时消化传代。

用第3代细胞接种材料。

1.2.2材料与骨髓基质细胞共培养及ALP活性检测用电子分析天平称取2mg P⁃15多肽，溶于2mL 磷酸盐缓冲溶液中，用0.22μm滤器抽滤，制成1mg/mL 的P⁃15多肽液。

然后分别稀释成100、200、400μg/mL 各200μL。

在超净工作台内用分析天平称取10mg生物玻璃，置于24孔板的16孔内，均匀铺开，然后滴加40μg/mL的多肽液100、200、400μg/mL各4孔作为实验组，另留4孔生物玻璃作为阴性对照组，4孔不加生物玻璃作为空白对照组。

严密包扎孔板，置于150r/min 摇床中离心12h，干燥后备用。

第2代细胞生长汇合达80%以上时消化细胞，调整细胞悬液为2×105/mL-1，接种在已铺好复合材料（生物玻璃/P⁃15）的24孔板内。

分别于1、3、7、10d检测各组骨髓基质细胞ALP活性和考马斯亮蓝总蛋白含量，通过紫外分光光度仪检测光密度值。

1.2.3兔颅骨缺损模型制备及材料植入将18只5月
龄健康雄性大耳白兔适应性饲养1周，肌内注射速眠新通用名0.7mL麻醉后固定于实验台，颅顶区常规消毒备皮，沿颅顶中线自眼眶后缘向颈根部做一3cm直线切口，用剥离子分离骨膜。

在距眼眶后缘、颅中缝0.5 cm处用裂钻磨制1cm×1cm的全层骨缺损区[复合材料组（生物玻璃复合质量浓度为200μg/mL的P⁃15多
肽）、阴性对照组（未复合P⁃15的生物玻璃）、空白对照组（不加生物玻璃）]，全程使用生理盐水降温。

将预先准备好的材料植入缺损区，拉拢缝合骨膜以固定材料，缝合皮肤。

术后视动物状态酌情给予苏醒药物，并肌肉注射60万U青霉素。

材料植入4、6、8周后麻醉、处死动物，迅速完整取下眶部以上的颅骨部分。

立即放入预先配好的4%多聚甲醛中固定。

1.2.4组织学标本制作及染色标本于4%多聚甲醛
中固定24～48h后沿冠状面片切，用甲酸进行脱钙1周。

常规石蜡包埋、切片、苏木精⁃伊红染色（HE染色），封片观察。

改良Gomori染色：（1）常规脱蜡，天青石蓝染液5min；（2）水洗，常规HE染色用明矾苏木精染液染细胞核，显蓝同HE染色；（3）用变色酸2R酸性复红染色5～10min；（4）用0.2%醋酸水溶液洗2～3次，肉眼观察骨组织呈红色，其他部分无色即可；（5）用亮绿染液复染；（6）用95%至无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

经此法染色后骨组织红染，胶原纤维等矿化程度较低的组织绿染。

1.2.5软X射线检查采用GIOTTO钼靶软X射线摄
片，将所摄X线片用数码单反相机拍照，采用Image pro plus选取骨缺损区域，segmentation工具定义正常骨
组织颜色，以排除未降解材料的影响，然后计算各组兔颅骨缺损X线片中骨缺损处成骨面积（area sum）。

将4周空白对照组兔颅骨缺损area sum定义为1，对4、6、8周复合材料组兔颅骨缺损成骨面积与4周空白对照组的比值进行统计分析。

1.3统计学处理应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用多样本均数单因素方差分析（one⁃way ANOVA）。

P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1复合材料对骨髓基质细胞ALP活性的影响复合材料与骨髓基质细胞共培养后细胞排列具有一定方向性，呈鱼群密集生长，材料周围可见细胞紧密排列，平行或垂直于材料接触面。

实验组骨髓基质细胞培养1d后ALP活性即高于对照组，且质量浓度为200μg/mL 的实验组骨髓基质细胞ALP活性培养1、4、7、10d后均明显高于质量浓度为100、400μg/mL的实验组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

见图1。

2.2不同材料修复兔颅骨缺损的软X 射线分析4周时复合材料组兔颅骨缺损区局部X 射线阻射影面积较阴性对照组大，射区域之间高密度影像连接较广泛，缺损处area sum 明显高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

6周时复合材料组兔颅骨缺损区X 射线阻射影密度较阴性对照组均匀，缺损处area sum 明显高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05），但仍可见未降解的材料和少部分低密度区域。

8周时复合材料组兔颅骨缺损区X 射线阻射面积明显大于阴性对照组、空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

见图2。

2.3不同材料修复兔颅骨缺损的HE 染色分析4周时复合材料组兔颅骨缺损区复合材料周边有新生骨小梁和部分纤维组织，周围有少量炎症细胞，骨细胞陷窝较多;材料中心已可见到细胞及类骨基质成分；材料之
间有骨小梁连接。

阴性对照组兔颅骨缺损区在生物玻
璃周围有薄层新骨形成，材料之间缺少骨组织的连接，由较多纤维组织包绕。

6周时复合材料组兔颅骨缺损区复合材料中心骨基质沉积明显，有细胞与周围骨小梁相连接，但材料周围新生骨的基质成分排列较紊乱；阴性对照组兔颅骨缺损区生物玻璃中心很少能观察到细胞成分，但颗粒状材料之间的骨组织比4周时明显增多、增宽。

8周时复合材料组兔颅骨缺损区复合材料中心有明显骨样组织沉积或可见梭形细胞呈网状，周围有成骨细胞紧密排列，形成的新骨可见板层样结构；阴性对照组兔颅骨缺损区生物玻璃中心可见细胞及基质，颗粒状材料之间新生骨组织较6周时继续增多，但结构紊乱。

见图3。

2.4不同材料修复兔颅骨缺损的改良Gomori 染色分
析4周时复合材料组兔颅骨缺损区复合材料（无色或绿染）周边有新生骨小梁形成，材料与颗粒之间及材料与正常骨组织之间紧密相连，但矿化程度不高；阴性对照组兔颅骨缺损区材料颗粒周围可见纤维组织，之间仅有薄层低矿化组织相连。

6周时复合材料组兔颅骨缺损区复合材料颗粒之间连接广泛，有类似髓腔结构形成，部分材料中心可见矿化组织沉积明显；阴性对照组兔颅骨缺损区材料之间彼此连接，但矿化程度稍低。

见图4。

A ：4周时兔颅骨缺损标本，右侧为复合材料组，左侧为阴性对照
组；B ：6周时兔颅骨缺损标本，右侧为复合材料组，左侧为阴性对照组；C ：8周时兔颅骨缺损标本，右侧为复合材料组，左侧为阴性对照组；D ：8周时兔颅骨缺损标本，右侧为阴性对照组，左侧为空白对照组；E ：各组兔
颅骨缺损处area sum 比较，与复合材料组比较，a
P <0.05
图2不同材料修复兔颅骨缺损的软X 射线分析
A B C D
E
B
A ：骨髓基质细胞与复合材料共培养后生长情况；
B ：各组骨髓基质
细胞ALP 活性比较，与质量浓度为200μg/mL 的实验组比较，a
P ＜0.05
图1复合材料对骨髓基质细胞ALP
活性的影响
A
A
：4周时复合材料组，箭头所指为材料与颗粒之间及材料与正常
骨组织之间紧密相连；B ：4周时阴性对照组；C ：6周时复合材料组；D ：6周时阴性对照组
图4不同材料修复兔颅骨缺损的改良Gomeri 染色分析
（Gomori 染色，100×）
A B C D
图3不同材料修复兔颅骨缺损的HE 染色分析（HE 染色，200×）
A ：4周时复合材料组，箭头所指为细胞及类骨基质成分；
B ：4周时
阴性对照组，箭头所指为薄层新骨形成；C ：6周时复合材料组，箭头所指为骨基质沉积明显；D ：6周时阴性对照组，箭头所指为颗粒状材料之间的骨组织比4周时明显增多、增宽；E ：8周时复合材料组，箭头所指为板层样结构；F ：8周时阴性对照组，箭头所指为生物玻璃中心可见细胞
A B C
D E F
3讨论
骨的有机成分中90％是由Ⅰ型胶原构成的，在其α1链上一段与间充质细胞结合且高度保守的15个氨
基酸序列（766⁃GTPGPQGIAGQRGVV⁃780）被称为P⁃15。

其促进成骨原理是这15个氨基酸残基组成的多肽
能与成骨细胞前体细胞上的整合素受体结合，促进细胞黏附。

因提供了更多的细胞结合位点，使整个修复过程从骨缺损灶内进行三维式的成骨，创造了一种有利于细胞各种生理活动和新骨生成的微环境，导致高度血管化的大量新骨生成。

本研究结果显示，生物玻璃复合P⁃15多肽后在植入6周时即可形成大量新骨，且材料内部形成类髓腔样结构，提示有新生血管。

KÜBLER等[8]将人成骨细胞分别接种于Bio⁃base®、Bio⁃Oss®、PepGen P⁃15®等骨替代材料，6、9d后测定不同组细胞活力和增殖情况，结果显示，PepGen P⁃15组细胞线粒体脱氢酶活性最强。

用相差倒置显微镜观察，PepGen P⁃15组成骨细胞围绕材料多层排列，且在颗粒之间形成桥连。

扫描电镜也证实了其他材料表面的细胞数量和层次均不及PepGen P⁃15[8]。

国内学者在制备胎牛骨无机骨基质（FABM）上培养了人颌骨间充质干细胞，结果发现，P⁃15能更有效地促进细胞与牛骨无机骨基质之间的黏附；在P⁃15对人颌骨间充质干细胞的弹性模量研究中发现，P⁃15改变了细胞膜弹性模量，从而影响了细胞黏附，表明多肽P⁃15可作为有效的促成骨生长因子用于骨粉表面修饰[9]。

本研究结果显示，复合材料组骨髓基质细胞ALP 活性较阴性对照组明显增加；当复合的P⁃15多肽质量浓度为200μg/mL时与复合材料共培养的骨髓基质细胞ALP活性明显高于质量浓度为100、400μg/mL的实验组及阴性对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），这种差异在接种后的前4d尤为明显，且细胞在复合材料周围生长良好，排列规则。

本研究采用复合材料的主体为生物玻璃。

生物玻璃是由钠盐、钙盐、磷酸盐和二氧化硅组成的一类生物材料。

当其与体液接触时会诱发3个阶段的反应，即扩散、溶出、凝集沉淀。

最终通过缩聚反应和一系列重新排布形成了硅凝胶层[10]。

该凝胶层具有较大的表面积，对蛋白多肽类具有一定吸附作用[11]。

因此，本研究选择生物玻璃作为P⁃15多肽的载体。

本研究软X射线结果显示，复合材料组与阴性对照组比较，新骨形成面积较多，密度较均匀；组织学切片结果显示，复合材料内部较早出现细胞成分，未降解颗粒之间有众多骨小梁相连，骨细胞陷窝多见，新骨形成速度及矿化程度均优于阴性对照组。

邓飞龙等[12]对P⁃15类材料的研究也证实了P⁃15多肽能将更多的细胞成分引入缺损处，从而加速新骨生成。

另有动物实验研究表明，PepGen P⁃15的早期骨修复能力强于Bio⁃Oss及Cerasorb[13]。

国外学者的2项多中心实验证明了PepGen P⁃15在治疗牙周病骨缺损中的成骨效果[14]。

但因体外与体内环境具有差异，本研究中细胞与材料的体外共培养筛选出的多肽质量浓度对体内实验的指导意义具有局限性。

综上所述，本研究通过体外细胞培养筛选出适宜成骨的P⁃15多肽质量浓度，与生物玻璃复合后植入兔颅骨缺损模型中经软X射线分析和组织学检查结果证实，复合材料的骨修复能力得到了一定的提高。

本研究采用胶原仿生多肽来提高原有材料的成骨活性，希望能为骨替代材料的研究开辟思路。

参考文献
[1]向柄彦，郭元．载药组织工程支架的构建及其性能研究[J]．现代医药
卫生，2015，31（9）：1281⁃1282．
[2]LIU T，ZHENG Y，WU G，et al.BMP2⁃coprecipitated calcium phosphate granules enhance osteoinductivity of deproteinized bovine bone，and bone formation during critical⁃sized bone defect healing[J].Sci Rep，2017，7：41800.
[3]王帅，周延民．粘附肽复合骨诱导材料的研究进展[J]．口腔医学
研究，2010，26（2）：292⁃294．
[4]EMAM HA，BEHIRI G，EL⁃ALAILY M，et al.The efficacy of a tissue⁃engineered xenograft in conjunction with Sodium hyaluronate carrier in maxillary sinus augmentation：a clinical study[J].Int J Oral Maxillofac Surg，2015，44（10）：1287⁃1294.
[5]GHIVARI S，PATIL AC，PATIL S，et al.Interdisciplinary manage⁃ment of an isolated intrabony defect[J].Case Rep Dent，2014，2014：672152.
[6]GOYAL J，SACHDEVA S，SURESH D K，et al.A Novel Combination Of Platelet Rich Fibrin And Pepgen P⁃15Xenograft，In The Treatment Of Intrabony Defects:A Volumetric Ct Scan Analysis[J].Ind J of Dent Sci，2013，5（4）:80⁃83.
[7]VULPOI A，GRUIAN C，VANEA E，et al.Bioactivity and protein attach⁃ment onto bioactive glasses containing Silver nanoparticles[J].J Biomed Mater Res A，2012，100（5）：1179⁃1186.
[8]KÜBLER A，NEUGEBAUER J，OH JH，et al.Growth and proliferation of human osteoblasts on different bone graft substitutes：an in vitro study[J]. Implant Dent，2004，13（2）：171⁃179.
[9]程伟．胎牛松质骨来源组织工程骨的构建及其理化、生物学特性研
究[D]．南京：南京大学，2015．
[10]MACEDO NL，MATUDA FDA S，MACEDO LG，et al.Bone defect re⁃generation with bioactive glass implantation in rats[J].J Appl Oral Sci，2004，12（2）：137⁃143.
[11]姜达君，贾伟涛，张长青．生物玻璃在骨修复中的研究进展[J]．中国
修复重建外科杂志，2017，31（12）：1512⁃1516．
[12]邓飞龙，马建元，简裕涛，等．两种植骨材料促进即刻种植体周骨组织
再生效果比较[J]．中山大学学报（医学科学版），2007，28（4）：470⁃472．[13]池珩，刘晓燕，靳爱萍．3种骨代用品修复骨缺损的组织学定量分析[J]．
广东牙病防治，2013，21（4）：177⁃183．
[14]YUKNA RA，KRAUSER JT，CALLAN DP，et al.Multi⁃center clinical comparison of combination anorganic bovine⁃derived hydroxyapatite matrix（ABM）/cell binding peptide（P⁃15）and ABM in human peri⁃odontal osseous defects.6⁃month results[J].J Periodontol，2000，71（11）：1671⁃1679.
（收稿日期：2018⁃05⁃29）。