一种简便的病原真菌单孢分离方法研究_龚国淑

文章编号：1005-0906(2010)01-0126-02
一种简便的病原真菌单孢分离方法研究
龚国淑，徐琴，张敏，杨继芝，陈华保，申世安，唐太飞
(四川农业大学农学院，四川雅安625014)
摘要：研究一种简便、实用、高效的病原真菌单孢分离法——
—挑针转移法，即用尖细而光滑的挑针从培养物或标样上挑取孢子，将其转移到清水琼脂块上，然后挑取分散的单个孢子转移到另一琼脂块上获得单孢。

通过对多种真菌的分离表明，该法操作简便，成功率可达90%以上。

关键词：玉米病害；病原真菌；单孢分离；挑针转移法
中图分类号：S435.131文献标识码：A
A Simple Method for Single Fungal Spore Isolation
GONG Guo-shu,XU Qin,ZHANG M in,YANG Ji-zhi,et al.
(Agricultural College of Sichuan Agricultural University,Ya’an625014,China) Abstract:This paper presented a method to isolate single fungal spore_dissect needle removing spore method. Spores were removed directly from culture or disease sample using sterilized dissect needle and placed in water agar piece.Single spore then was picked and removed to next water agar piece.Finally,water agar piece containing single spore were cultured until spore reached a clear colony.The method was simple,convenient and practical on fungi dis-ease research.The whole isolation procedure only involved in some simple instruments and success percentage could reach90to obtain single spore.
Key words:M aize disease;Pathogenic fungi;Single spore isolation;Dissect needle removing spore method
真菌病害研究中常会涉及到病原菌的纯培养问题，尤其在研究病原菌群体遗传特征时总会用到单孢分离技术。

单孢分离法较多，主要依据各实验室的设备和使用习惯，有些方法相当繁琐。

评价一种方法的优劣关键看操作难易度、成功率高低以及适用范围等。

如采用切取器分离法[1]，制作和安装切取器较麻烦，且不好操作；采用玻璃针挑取法，用具制作繁琐，操作不方便[2]；琼脂平板切割纯化法，则要在单孢处作上记号，然后切割单孢琼脂块，切割的范围不好控制，邻近的孢子陷入缝隙中不易发现，难保证单孢子[3，4]。

直接将涂有孢子的琼脂平板放置在显微镜下
收稿日期：2009-01-22；修回日期：2010-01-06
基金项目：国家现代玉米产业技术体系、四川玉米创新团队、四川省教育厅重点项目(08ZA0800)、2009年雅安市科技局项目、
四川省应用基础项目(03JY029-033-1)、四川农业大学校
科技基金(1301)
作者简介：龚国淑(1964-)，女，四川泸县人，博士，教授，博士生导师，主要从事植物病理学和微生物生态学方面的相关研
究。

Tel：0835-*******E-mail：guoshugong@ 挑取，培养皿不能固定，也不能随意移动[5，6]。

如果需要制作特殊的用具，如玻璃针、眉毛挑针[7]，制作较麻烦，在使用过程中不能随时灭菌。

在病原真菌分离纯化中试用了不同的单孢分离法，并改良出一种简便易行、成功率高的分离法，该方法不仅适宜从菌落中挑取单孢，还适宜从病部甚至被杂菌混杂的材料中获得单孢。

1材料与方法
1.1材料及用具
1.1.1病害标样
玉米弯孢菌叶斑病(Curcularia lunata)、灰斑病(Cercospora zeae-maydis)、大斑病(Exserohilum turci－cum)、小斑病(Bipolaris maydis)。

每种病害提供20份来源不同的材料。

1.1.2新鲜培养物
新月弯孢菌(Curcularia lunata)、玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)、大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)、玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)。

每种病原菌提供20个来源不同的组织块分离物。

玉米科学2010，18(1)：126～127，134Journal of M aize Sciences
1.1.3仪器及用品
显微镜、超净工作台、挑针(解剖针)、解剖刀、玻片、清水琼脂、无菌水、酒精等实验室常规用品。

1.2实验方法
1.2.1病组织的保湿培养
取病害标样用75%酒精消毒30s 左右，然后用无菌水冲洗。

在干净的培养皿中放入两层吸水纸，加入少量无菌水(浸湿吸水纸即可)，
把冲洗过的病组织放在吸水纸上，盖好后室温保湿培养1～2d 。

1.2.2清水琼脂(WA)和无菌水的制备
3.0%清水琼脂培养基：为了保证挑针不易刺破WA 平板表面，琼脂的浓度比一般培养基大。

制作前应先浸泡淘洗干净，使WA 尽量透明。

制备时按常规培养基添加孟加拉红或链霉素以抑制细菌，灭菌后制成约2～3mm 厚的平板备用。

无菌水：制备时也应添加孟加拉红或链霉素以抑制细菌。

1.2.3挑针或解剖针的制作
挑针的制作同一般解剖针，但要求用针尖光滑、细而长的缝衣针，如果用昆虫针则需要打磨光滑。

1.2.4显微镜的准备
将自带光源的显微镜放入超净工作台上，用无菌脱脂棉蘸无水乙醇擦净镜头和载物台，紫外灯照射30min 后备用。

1.2.5操作方法
用解剖刀切取约1.5cm ×2.0cm 的琼脂块放在无菌载玻片上，再将其切成约5mm ×5mm 的小块，每小块留一定间隙分开。

挑针灭菌后在无菌水中湿润一下，从培养好的菌落或保湿的病斑上粘取少许孢子，依次在3～5个琼脂块上轻点一下(不要刺破琼脂表面)，在10×10视野下找到孢子量最少的琼脂块，若不是单孢或有其他杂菌，用无菌湿润的挑针在低倍视野下清晰地将针尖轻轻接触孢子，确信孢子已经吸到挑针后，在低倍镜下把针尖上的孢子放到另一块琼脂表面，如此反复重复，确信每一琼脂块上仅有一个孢子后，用接种铲将粘有单孢的琼脂块移至适宜的平板或斜面培养基上，孢子的一面向上。

每份供试材料按上述操作挑取5个单孢琼脂块，每种病原菌从病害标样和培养物上分别挑了100个单孢琼脂块，培养7d 后统计分离成功率。

2
结果与分析
2.1
挑针转移法的成功率及效率
从表1可看出，采用挑针转移法进行真菌的单
孢纯化成功率较高，在WA 和无菌水中添加抑制细菌的物质，其成功率可达90%以上。

该法操作简便，无需特殊用具，熟练后平均每小时可获得40～50个单孢，效率较高。

病原菌培养物95969997病害标样(保湿)
92
93
99
96
材料Materials 弯孢菌叶斑病Curcularia lunata
灰斑病
Cercospora zeae-maydis
大斑病Exserohilum turcicum
小斑病Bipolaris maydis
表1
用挑针转移法获取单孢培养物的成功率
Table 1Success percentage to obtain single spore using dissect needle removing spore method
%
2.2挑针转移法的技术要点
(1)挑针尖细而光滑，根据孢子大小选择针的
粗细。

(2)在视野下挑与放时持针要平稳，挑时可将手腕轻支撑于载物台边上可保证针不晃动。

(3)严格控制无菌操作环境。

(4)琼脂块要现用现制，保证表面湿润，挑取孢子时针尖也要湿润。

3讨论
通过对各类真菌的纯化工作验证，挑针转移法
适用范围较广，凡低倍视野下清晰可见的孢子均可，如炭疽病(Colletotrichum spp.)、镰刀菌(Fusarium spp.)、
链格孢(Alternaria spp.)等。

该法特别适用于直接从病害标样上挑取单孢，当标样不新鲜或不单一、病原菌在培养基上生长缓慢时，用这种方法获得纯培养的成功率较高，这是其他常用单孢纯化法不可比拟的地方。

此外，常用的如琼脂平板切割法、平板稀释划线法较复杂，效率也较低。

一般待孢子萌发后再切割琼脂块，切割时需将整个培养皿置于载物台上，需要在倒置显微镜下才容易操作，而且培养皿不好固定，切割时容易接触相邻的孢子，纯度难以保证。

参考文献：
[1]方中达.植病研究方法(第三版)[M].北京：农业出版社，1998.[2]李清铣.植物病理学实验指导[M].上海：上海科技出版社，1981.
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龚国淑等：一种简便的病原真菌单孢分离方法研究1期
(上接第127页)
[3]高玉亮，李葵花.病原真菌单孢子显微镜下分离技巧[J].植物保
护，1999，25(6)：505.
[4]姜开梅，范静华，朱有勇.玉米大斑病的分离、培养及产孢方法的
研究[J].云南农业大学学报，2004，19(3)：272-274.[5]李晓，刘振钦，刘晓龙，等.大型经济真菌单孢分离方法的研究
[J].吉林农业大学学报，2002，24(3)：41-42.
[6]张书建，何月秋.介绍一种简单的真菌单孢子分离法[J].云南农
业大学学报，2003，18(3)：315-316.
(责任编辑：朴红梅)
(上接第130页)
[11]李春霞，苏俊，龚士琛，等.黑龙江省中南部地区玉米大斑病
菌生理小种变异的研究[J].玉米科学，2003，11(4)：80-81. [12]桂秀梅，董金皋，侯晓强.中国2001年玉米大斑病菌生理小种
鉴定[J].河北农业大学学报，2003，10(1)：11-13.[13]赵辉，高增贵，张小飞，等.东北春玉米区大斑病菌生理小种
鉴定[J].植物保护，2007，33(6)：31-34.
[14]Pataky J K.Race23N of Exserohilum turcicum in Florida[J].Plant
Disease,1991,75(8):863.
(责任编辑：尹航)
试验结果表明，进行玉米瘤黑粉病抗病性鉴定时，其接种的最佳方法是注射法。

注射器针头可直接刺入到玉米植株叶轮至茎秆处，此部位接近幼穗生长发育部位，病菌可与寄主幼嫩组织直接接触使侵染成为可能，并且针头刺过植株茎秆会留下创伤口，为病原菌的侵入创造了条件。

用注射法接种能做到定量、定时、定部位，且造成伤口大小也相同，因而受环境干扰小，可重复性、稳定性、准确性均较好，由于工作量小，适宜于大田多个品种的抗性鉴定。

玉蜀黍黑粉菌是黑粉菌中局部侵染的代表类型，菌原自侵染点向外可作一定距离的弥散，但不是系统侵染，发病部位一般在病原侵入点周围，且侵染与寄主生育阶段有关。

本研究中，玉米瘤黑粉接种的最佳时期为6叶1心期，这与张春民等的研究结果一致。

在3叶1心期时接种发病率普遍偏低，这可能与苗期温度比较低有关，低温不利于孢子的萌发。

用于注射接种法的3个浓度所引起植株的发病率不同，随着菌液浓度加大发病率明显提高，但当浓度达到一定量时发病率并没有继续上升，说明注射浓度不是菌量越大接种效果越好。

在本试验中，9×103～10×103个孢子/mL浓度接种效果最好，10个参试品种均表现出最大发病率，但此剂量是否为最佳浓度还有待进一步的研究。

参考文献：
[1]Shurtleff M pendium of corn diseases.(2nd edn)American Phy-
topathologicalScoiety[M].St.Pau1,Minnesota.1971:45-46.
[2]Zscheischler J,Estler M C,Gro B,et a1.Mais.Anbau and Verwertung
[M].DLG-Verlag,Frankfurt/Main,1979:51-52.
[3]刘惕若.黑粉菌与黑粉病[M].北京：农业出版社，1984.
[4]鄂文弟，王振华，张立国，等.玉米瘤黑粉病的研究进展[J].玉米
科学，2006，14(1)：153-157.
[5]李春民，徐雅洁，于俊香，等.2000年巴林左旗玉米瘤黑粉病大发
生的原因及防治对策[J].内蒙古农业科技，2001(5)：42-43.
[6]方中达.植病研究法[M].北京：农业出版社，1998.
[7]张春民，刘玉英，石洁，等.玉米瘤黑粉病抗性鉴定技术研究[J].
玉米科学，2005，13(3)：109-111.
[8]刘长华，王振华.玉米丝黑穗病田间接种浓度与发病率关系的研
究[J].玉米科学，2008，16(1)：119-121.
[9]Thakur R P.Smut gall development in adult corn plants inoculated
with ustilago maydis[J].Plant Disease,1989(11):921-925.
[10]王晓鸣，戴法超，廖琴，等.玉米病虫害田间手册[M].北京：中
国农业出版社，2002.
(责任编辑：尹航)
18卷
玉米科学
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