HPLC法测定肿瘤细胞中5-氟尿嘧啶的浓度

HPLC法测定肿瘤细胞中5-氟尿嘧啶的浓度
黄灿;许杜娟;夏泉;苏涌
【摘要】Objective To establish an HPLC mothod to determine 5-fluorouracil in tumor cells. Methods The column: Diamonsil C18 column( 4.
6 mm x 250 mm, 5 μm )was adopted with the mobile phase of methanol-water( 10:90 ). The flow rate was 1.0 ml · Min -1. The detection wavelength was at 265 nm,and the column temperature was 25℃. Results The calibration curves were linear between 0. 0565 and 1. 808 mg · L-1 ( r2 =0. 999 8 ). The recovery( n =5 )was more than 96. 6%. Intra-day RSD and
inter-day RSD were both less than 8. 0%( n =5 ). Conclusion The method is convenient and rapid with good specialization. It can be used for drug resistance mechanism study and pharmacokinetics study of 5-fluorouracil.%目的建立HPLC法测定肿瘤细胞中5-氟尿嘧啶的浓度.方法采用Diamonsil C-18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-水(10:90)为流动相,流速为1.0 ml·min-1,检
测波长为265 nm,柱温25℃.结果线性范围为0.056 5～1.808 mg·L-
1(r2=0.9998);回收率(n=5)大于96.6%;日间、日内精密度实验的RSD(n=5)均小
于8.0%.结论该试验建立的方法简便、快捷、专属性强,可用于临床研究5-氟尿嘧啶的耐药机制,也可用于5-氟尿嘧啶的药代动力学的研究.
【期刊名称】《安徽医药》
【年(卷),期】2012(016)002
【总页数】2页(P173-174)
【关键词】5-氟尿嘧啶;高效液相色谱;肿瘤细胞
【作者】黄灿;许杜娟;夏泉;苏涌
【作者单位】安徽医科大学药学院,安徽,合肥,230032;安徽医科大学药学院,安徽,合肥,230032;安徽医科大学第一附属医院药剂科、国家中医药管理局中药化学三级实验室,安徽,合肥,230022;安徽医科大学第一附属医院药剂科、国家中医药管理局中药化学三级实验室,安徽,合肥,230022;安徽医科大学药学院,安徽,合肥,230032【正文语种】中文
5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床常用的抗肿瘤药物，对组织肿瘤如胃癌、肝癌、结肠癌等有显著疗效［1，2］。

但临床使用发现，患者长期用药会使肿瘤细胞对药物的敏感性降低并产生多药耐药性(MDR)，严重影响了临床化疗的效果。

目前多药耐药的机制尚不明确，但有文献报道，肿瘤细胞的细胞膜上有类似于药物泵的物质能将抗肿瘤药物泵出细胞外，造成细胞内药物浓度降低，降低细胞毒作用，诱导细胞耐药［3～8］。

因此，监测肿瘤细胞内的药物浓度，一方面可以深人研究抗癌药物的耐药机制，另一方面也可以用于5-氟尿嘧啶的药代动力学研究。

为此，本文以BEL-7402细胞(人肝癌细胞)为研究对象，建立了测定肿瘤细胞内5-FU浓度HPLC方法。

1 仪器与试药
1．1 仪器高效液相色谱仪Agilent 1100 Series，二极管阵列检测器(DAD)，Diamonsil C-18柱;上海沪西分析仪器厂有限公司XW-80A型旋涡混合器;德国Eppendorf公司5415R型高速冷冻离心机，细胞超声粉碎仪。

1．2 药品与试剂 5-氟尿嘧啶对照品(中国药品生物制品检定所，批号100187);5-
氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司，批号0810211);甲醇为色谱纯;去离子水;PBS 缓冲液;人肝癌细胞BEL-7402，购自南京凯基生物科技发展有限公司。

2 实验方法与结果
2．1 色谱条件色谱柱为 Diamonsil C18柱，检测波长:265 nm，柱温:25℃，进
样量:20 μl，时间:10 min。

2．2 对照品储备液的制备精密称取1．13 mg 5-FU的对照品，用流动相制成浓
度为45．2 mg·L－1的对照品储备液，于4℃下避光保存。

2．3 样品处理取培养好的人肝癌细胞BEL-7402适量，用PBS洗涤5次后，使
细胞从瓶壁上完全脱落下来。

4℃1 000 r·min－1离心5 min，弃去上清，加入0．5 ml的 PBS吹打均匀后，吸取到EP管中，分别放在细胞超生粉碎机中超声
10 min，然后在4℃12 000 r·min－1离心机中离心30 min，吸取上清液于另一
干净的EP管中，用氮气吹干，加入流动相定容至0．5 ml，4℃避光避光保存，
供HPLC分析。

2．4 标准曲线的制备精密量取5-FU对照品贮备液适量，按“2．3”项下的方法，制备浓度分别为为 1．808，0．904，0．452，0．226，0．113，0．056 mg·L －1的细胞液标准液。

取上述溶液各20 μl注入色谱仪，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱图和峰面积，峰面积分别为 60．3，30．1，15．9，7．5，4．3，2。

以峰面积(A)为纵坐标，5-FU的浓度(C)为横坐标作线性回归，得标准曲线回归方程为 A=33．158C+0．3458，r2=0．9998(n=5)。

结果表明5-FU 在
1．808 ～0．056 mg·L－1范围内呈现良好的线性关系。

2．5 专属性实验取培养好的空白细胞液、加人对照品的细胞液和样品细胞液，分别按“2．3”项下方法操作分析，所得色谱图见图1。

可见细胞中内源性物质不
干扰细胞内5-FU浓度的测定。

图1 5-FU HPLC色谱图
2．6 回收率试验精密量取5-FU对照品储备液适量，按“2．3”项下的方法，配制低、中、高3 种浓度(0．056、0．113、1．808 mg·L－1)，的细胞液各5份，进行测定，对样品的测定值进行统计处理，以实测浓度与标示浓度的比值计算方法回收率，结果见表1。

其结果表明方法回收率良好。

表1 方法回收率试验(±s，n=5)样品浓度/mg·L－1实测浓度/mg·L－1方法回收
率/%RSD/%0．056 0．054 ±0．0056 96．6 ±10 8．6 0．113 0．114
±0．0050 101 ±4．4 4．3 1．808 1．859 ±0．0390 103 ±2．1 2．1
2．7 精密度试验精密量取5-FU对照品储备液适量，按“2．3”项下的方法，配制低、中、高 3 种浓度(0．056、0．113、1．808 mg·L－1)的细胞液各5份，
按照日内和日间精密度的要求，日内平行测定5次，日间平行测定5次，记录峰
面积，代入标准曲线计算日内、日间测得日内和日间相对标准差，结果见表2。

其结果表明方法精密度良好。

表2 精密度试验(±s，n=5)精密度RSD/%日内样品浓度/mg·L－1实测浓度/mg·L －1 0．056 0．054 ±0．0028 5．1 0．113 0．106 ±0．0045 4．3 1．808 1．655 ±0．0630 3．8日间 0．056 0．053 ±0．0038 7．2 0．113 0．105
±0．0047 4．5 1．808 1．600 ±0．044 2．7
2．8 稳定性试验精密量取5-FU对照品储备液适量，按“2．3 ”项下方法，配
制浓度为0．113 mg·L－1的细胞液，在0、1、3、6、9、12、15、24、48 h
分别测定，结果峰面积分别为0．1128、0．1122、0．1115、0．1108、0．1100、0．1087、0．11057、0．1011、0．09814。

5-FU浓度的RSD(n=9)为4．7%。

表明细胞溶液在48 h内稳定性良好。

2．9 肿瘤细胞内5-FU浓度的测定选指数生长期的人肝癌细胞BEL-7402，计数
后细胞接种于培养瓶中，每瓶的细胞数为0．53×106个·ml－1，24 h贴壁后分
别向耐药细胞中加入5-FU适量，使其终浓度为25 mg·L－1，继续培养24 h后，
按“2．3”项下方法操作分析，测得细胞内5-FU的浓度为(1．01 ±0．04)mg·L －1。

3 讨论
流动相的选择。

在实验初采用乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相，但在实验过程中发现
采用此流动相时5-FU出峰过早，随溶剂峰一起出峰，在色谱柱上没有保留。

经过后期多次实验采用了甲醇-水为流动相，二者的比例对实验影响也很大，曾在实验
中试用过25%、20%、15%、10%的甲醇比例。

其结果表明随着甲醇比例的减少，药物色谱峰的保留时间延长，细胞内源性干扰物质的色谱峰保留时间变化不大。

当甲醇的比例为10%时，5-FU出峰时间适中，且细胞内源性物质不干扰测定，因此本试验选用了甲醇∶水(10∶90)为流动相。

对加人细胞中5-FU的药物浓度进行考察，在试验中发现若5-FU浓度过大，会导致细胞大量死亡，使可供测定的细胞数量减少若5-FU浓度过小，会导致细胞内药物浓度过低，无法准确测出。

经过一系列试验，最后确定25 mg·L－1为加人细胞中5-FU的药物终浓度。

利用HPLC测定血浆中5-FU浓度有不少报道［9，10］，但肿瘤细胞中5-FU浓
度的HPLC检测方法尚未见报道。

本文研究和建立的分析方法前处理简便、快速，色谱条件合理，仪器的灵敏度高，出峰时间快，没有杂质干扰5-FU的检测，为临床研究5-FU的耐药机制提供可靠的分析手段。

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