噬菌体cDNA展示文库技术及其在寄生虫学中的应用
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技术 ,实现了基因型与表型的 统一 ,即蛋白质通过基因工程的方法融合到噬菌体 衣壳蛋白上 ,使融合蛋白展示在噬菌体颗粒的外部 , 而编码融合蛋白的 DNA 则位于病毒颗粒内部 [ 2 ] 。
M13 [ 3 ] 。噬 菌体展示技术最早和最常用的载体是 M13、f1或 fd 丝状噬菌体 ,因为这几种噬菌体的基因容易人为改 造并获得高滴度 ( 1011 ～1012个病毒颗粒 /m l) [ 426 ] 。 业已证明 M13 / fd最适合作为小分子肽库或抗体文特性有关 ,例如融合蛋白产
序列之 列 。而 c2Fos和 c2Jun之后即 N 末端又分别插入了 p Ⅲ片段 和 cDNA 片段 。这些融合产物在 PelB 领头链的作 用下趋向于噬菌体组装的场所即大肠杆菌的周质 腔 。随后 , c2Fos和 c2Jun借着极大的亲和力在周质 腔内相互连接 ; 另一方面 ,由于 p Ⅲ的 C 端保留完 整 ,所以能够组装到噬菌体的衣壳里 ,而 cDNA 表达 产物借着这种亮氨酸拉链的高亲和力作用而与噬菌 体的衣物能够连接 到噬菌体衣壳上是由于亮氨酸拉链上的半胱氨酸残 基之间形成了二硫化合物 。 3. 1. 2 以 PⅥ为基础03·
·综述 ·
张素华 钱程 吴海玮 3
【术的丝状噬菌体 M13以及目前术广泛应用于各种天然配体 2受体相互 作用的研究 ,是研究各种寄生虫的结构与功能的基础 ,在寄生虫病诊断与致病机制研究及疫苗开发与药 物研制等方面发挥重要作用 。 体
well as the characteristics of various phagem id vectors used to construct the cDNA exp ression library. The re2 view is focused on the filamentous phage M13 which was firstly used in phage disp lay system andλ phage w idely used currently. Being a branch of phage disp lay libraries, cDNA exp ression library is w idely used in the investi2 gation on the natural ligand2recep tor interactions. It is the foundation for studying the structures and functions of various parasites and p lays an important role in the diagnosis of parasitosis, pathogenic mechanism investiga2
p Ⅵ基因产物是丝状噬菌体的次要外壳之一 ,相 比 p Ⅲ和 p Ⅷ基因产物对于噬菌体繁殖所起的重要 作用 ,其 C端容纳外源插入的潜力较大 。实验观察 到 p Ⅵ能连接噬菌体和有宿主结合性的 p Ⅲ,而且可 能拥有一个亲水性的暴露 C 端 [ 11 ] 。基于 p Ⅵ基础 上的 cDNA 表面展示业已产生 [ 10, 21 ] 。
作者单位 : 210029 南京 ,江苏省现代病原重点实验室 ;南京医科大学 病原生物学系 3 通讯作者 :吴海玮 , E2mail: haiwei@ njmu. edA 反转录成 cDNA 片段 ,然后插入 到载体基白质 , 展示的蛋白位于噬菌体表面 ,空间位阻小 ,因此可保 持相对独立的空间结构和生物活性 。由于 cDNA 文 库的成分比较复杂 ,展示在噬菌体表面的蛋白质更 具多样性 ,从而增加了用特异的配体筛选到与之结 合力更强的目的分子的可能性 。
jespers等构建基于噬菌白酶抑制剂家族新成员的ednam13pvi单价展示系统可快速分离特异性edna有助于发现新的具有重要生物学意义的配体
国际医学寄生虫病杂志 2007年 3月第 34卷第 2期 Int J Med Parasit D is,Mar 2007, Vol. 34, Ⅵ的表达展示系统 ,而其他的如 p Ⅷ衣壳蛋 白 ,则不能有效展示大的蛋白模体 ,可能是破坏了噬 菌体的组装和 (或 )重组蛋白的易位 ,但也不乏成功 的例子 [ 22 ] 。一般来说 ,M13噬菌体仅能展示长度为 20个氨基酸残基以内的寡肽或多肽 ,作为 cDNA 文 库的展示载体 ,不能用于展示结构复杂的蛋白质 ,否 则会影响噬菌体形态 。 3. 2 λ噬菌体展p Ⅷ两个衣壳蛋白 C端的完整性 对于噬菌体颗粒的组装非常重要 ,所以融合的目的 基因只能插入到其 N 端 [ 18 ] 。然而编码任何蛋白质 C端的 cDNA 插入片段作为 N 末端融合是不可能被 组装进噬菌体外壳的 ,因为 cDNA 插入片段羧基端 的翻译终止密码子阻止了融合蛋白的合成 [ 19 ] 。所 以 ,研究者针对 M13作为表达载体存在的问题进行 了改进 ,新的克隆策略应运而生 ,包括以 p Ⅲ和 p Ⅵ 为基础的展示系统 。 3. 1. 1 以 p Ⅲ为基础的展示系统
Phage d isplay of cD NA library and its applica tion in para sitology ZHAN G S u2hua, Q IAN Cheng, WU Ha i2w ei3 . 3 D epa rtm en t of Pa thogen B iology, J iangsu P rovincia l Key L abora tory of M odern Pa thogen B iolo2
tion, vaccine development and drug research. 【Key words】 Phage disp lay; cDNA library; Parasitology; M13 phage; λ phage
1 概述 噬菌体表面展示技术的原理是将编码外源多肽
或蛋白质的基因片段与噬菌体衣壳蛋白的基因融 合 ,使外源多肽或蛋白质得以呈现于噬菌体衣壳蛋 白的表面 。1985年 , Sm ith[ 1 ]在前人对丝状噬菌体分 子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术 (phage disp lay) 。常用的丝状噬菌体有 M13、f1 和 fd,而与噬菌体表面展示技术最密切相关的 2 种结 构蛋白是 p Ⅲ和 p Ⅷ。当一组随机多肽编码序列或 某种生物的基因插入噬菌体基因中2 brary) 。其中 ,噬菌体肽库和抗体库的应用在 20 多 年的发展技术不完全一样的 ;后者 外源蛋白不是表面展示 ,而是与一些标志蛋白如谷 胱甘肽还原酶 GST等一起进行融合表达 。 2 技术背景
此外 ,利用非丝状噬菌体的许多其他展示系统 也逐步发展起来 。包括融合到 λ噬菌体尾部蛋白 Ⅴ[ 12 ]和衣壳蛋白 D[ 13, 14 ] 的展示系统 , T4 噬菌体展 示系统 [ 15 ] 以及 T7 噬菌体展示系统 [ 16, 17 ] 库的构建系统 3. 1 M 13噬菌体展示系统
物在噬菌体组装前需要分泌的问题 [ 7 ] 。任何与衣 壳蛋白融合的 cDNA 基因产物 ,只要它的一些特性 阻止其跨膜就不会被分泌出去 ,也就不会组装到噬 菌体衣壳中 ,这显然对分泌性蛋白质有利 。因此 , M13作为噬菌体展示工具时 ,胞内蛋白 、核蛋白等就 不会被分泌出去 ,在筛选时则易产生偏差 ,分泌性是 M13最主要问题之一 。例 如 :基于 c2Fos和 c2Jun亮氨酸拉链而形成异二聚体 的 PJUFo系统 [ 8, 9 ]及外源蛋白融合到 M13 p Ⅵ衣壳 蛋白羧基末端的展示系统 [ 10, 11 ] 。这两种展示系统 能够缓解 M13 展示系统遇到的翻译终止密码子难 题。
λ噬菌体的最的 组装发生在宿主菌的细胞质内 ,因此不需要融合蛋 白质分泌出去 ,并且适合把目的 cDNA 片段插入到 编码衣壳蛋白 D 基因的 3′末端 ,这就允许克隆全长 的 cDNA 产遇到的有关翻译 终止密码子和蛋白分泌方面的两个难题 。
© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
·104·
国际医学寄生虫病杂志 2007年 3月第 34卷第 2期 Int J Med Parasit D is,Mar 2007, Vol. 34, No. 2
以 p Ⅲ为基础的展示系统最突出的特点是对外 源多肽或蛋白质的大小无严格限制 ,已成功展示相 对分子质量 (M r)大至 50 000的蛋白质 ,且可筛选到 高亲合力的受体 。然而 ,由于 cDNA 片段羧基末端 含有终止密码子 ,使得与 M13 噬菌体的 p Ⅲ不可能 和 p Ⅷ衣壳蛋白的 N 端融合 。 c2Fos和 c2Jun之间形 成亮氨酸拉链 ,从而在 p Ⅲ产物与表面表达的 cDNA 产物之间提供一个共价连接即可解决该问题 。在噬 菌体 PComb3的基础上 ,结合 c2Fos和 c2Jun之间能 够形成稳定的氨基酸拉链 , C ram eri等 [ 19, 20 ] 构建了 一个名为 PJUFo的崭新的展示系统 。在 PComb3的 构建策略里 ,包含 2个独立的乳糖启动子 ,其后分别 紧挨着 PelB 信号肽序列 。Crameri等在 2 个信号肽
应用最多的是在 λ噬菌体头部蛋白 D 的 3′末 端插入目的基因 。 1998 年 , Santini等 [ 18 ] 利用载体 λpRH8示在噬菌体表 面 。基于 D 端融合且质粒载体包含一细胞中 ,这些细胞又被带有 Loxp 位点 的 λed ica l U n iversity, N an jing 210029, Ch ina
Correspond ing au thor: WU Ha i2w ei, E2m a il: ha iw ei@ n jm u. edu. cn 【Abstract】 The p rincip les and development of phage disp lay of cDNA library are elucidated here, as
M13 [ 3 ] 。噬 菌体展示技术最早和最常用的载体是 M13、f1或 fd 丝状噬菌体 ,因为这几种噬菌体的基因容易人为改 造并获得高滴度 ( 1011 ～1012个病毒颗粒 /m l) [ 426 ] 。 业已证明 M13 / fd最适合作为小分子肽库或抗体文特性有关 ,例如融合蛋白产
序列之 列 。而 c2Fos和 c2Jun之后即 N 末端又分别插入了 p Ⅲ片段 和 cDNA 片段 。这些融合产物在 PelB 领头链的作 用下趋向于噬菌体组装的场所即大肠杆菌的周质 腔 。随后 , c2Fos和 c2Jun借着极大的亲和力在周质 腔内相互连接 ; 另一方面 ,由于 p Ⅲ的 C 端保留完 整 ,所以能够组装到噬菌体的衣壳里 ,而 cDNA 表达 产物借着这种亮氨酸拉链的高亲和力作用而与噬菌 体的衣物能够连接 到噬菌体衣壳上是由于亮氨酸拉链上的半胱氨酸残 基之间形成了二硫化合物 。 3. 1. 2 以 PⅥ为基础03·
·综述 ·
张素华 钱程 吴海玮 3
【术的丝状噬菌体 M13以及目前术广泛应用于各种天然配体 2受体相互 作用的研究 ,是研究各种寄生虫的结构与功能的基础 ,在寄生虫病诊断与致病机制研究及疫苗开发与药 物研制等方面发挥重要作用 。 体
well as the characteristics of various phagem id vectors used to construct the cDNA exp ression library. The re2 view is focused on the filamentous phage M13 which was firstly used in phage disp lay system andλ phage w idely used currently. Being a branch of phage disp lay libraries, cDNA exp ression library is w idely used in the investi2 gation on the natural ligand2recep tor interactions. It is the foundation for studying the structures and functions of various parasites and p lays an important role in the diagnosis of parasitosis, pathogenic mechanism investiga2
p Ⅵ基因产物是丝状噬菌体的次要外壳之一 ,相 比 p Ⅲ和 p Ⅷ基因产物对于噬菌体繁殖所起的重要 作用 ,其 C端容纳外源插入的潜力较大 。实验观察 到 p Ⅵ能连接噬菌体和有宿主结合性的 p Ⅲ,而且可 能拥有一个亲水性的暴露 C 端 [ 11 ] 。基于 p Ⅵ基础 上的 cDNA 表面展示业已产生 [ 10, 21 ] 。
作者单位 : 210029 南京 ,江苏省现代病原重点实验室 ;南京医科大学 病原生物学系 3 通讯作者 :吴海玮 , E2mail: haiwei@ njmu. edA 反转录成 cDNA 片段 ,然后插入 到载体基白质 , 展示的蛋白位于噬菌体表面 ,空间位阻小 ,因此可保 持相对独立的空间结构和生物活性 。由于 cDNA 文 库的成分比较复杂 ,展示在噬菌体表面的蛋白质更 具多样性 ,从而增加了用特异的配体筛选到与之结 合力更强的目的分子的可能性 。
jespers等构建基于噬菌白酶抑制剂家族新成员的ednam13pvi单价展示系统可快速分离特异性edna有助于发现新的具有重要生物学意义的配体
国际医学寄生虫病杂志 2007年 3月第 34卷第 2期 Int J Med Parasit D is,Mar 2007, Vol. 34, Ⅵ的表达展示系统 ,而其他的如 p Ⅷ衣壳蛋 白 ,则不能有效展示大的蛋白模体 ,可能是破坏了噬 菌体的组装和 (或 )重组蛋白的易位 ,但也不乏成功 的例子 [ 22 ] 。一般来说 ,M13噬菌体仅能展示长度为 20个氨基酸残基以内的寡肽或多肽 ,作为 cDNA 文 库的展示载体 ,不能用于展示结构复杂的蛋白质 ,否 则会影响噬菌体形态 。 3. 2 λ噬菌体展p Ⅷ两个衣壳蛋白 C端的完整性 对于噬菌体颗粒的组装非常重要 ,所以融合的目的 基因只能插入到其 N 端 [ 18 ] 。然而编码任何蛋白质 C端的 cDNA 插入片段作为 N 末端融合是不可能被 组装进噬菌体外壳的 ,因为 cDNA 插入片段羧基端 的翻译终止密码子阻止了融合蛋白的合成 [ 19 ] 。所 以 ,研究者针对 M13作为表达载体存在的问题进行 了改进 ,新的克隆策略应运而生 ,包括以 p Ⅲ和 p Ⅵ 为基础的展示系统 。 3. 1. 1 以 p Ⅲ为基础的展示系统
Phage d isplay of cD NA library and its applica tion in para sitology ZHAN G S u2hua, Q IAN Cheng, WU Ha i2w ei3 . 3 D epa rtm en t of Pa thogen B iology, J iangsu P rovincia l Key L abora tory of M odern Pa thogen B iolo2
tion, vaccine development and drug research. 【Key words】 Phage disp lay; cDNA library; Parasitology; M13 phage; λ phage
1 概述 噬菌体表面展示技术的原理是将编码外源多肽
或蛋白质的基因片段与噬菌体衣壳蛋白的基因融 合 ,使外源多肽或蛋白质得以呈现于噬菌体衣壳蛋 白的表面 。1985年 , Sm ith[ 1 ]在前人对丝状噬菌体分 子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术 (phage disp lay) 。常用的丝状噬菌体有 M13、f1 和 fd,而与噬菌体表面展示技术最密切相关的 2 种结 构蛋白是 p Ⅲ和 p Ⅷ。当一组随机多肽编码序列或 某种生物的基因插入噬菌体基因中2 brary) 。其中 ,噬菌体肽库和抗体库的应用在 20 多 年的发展技术不完全一样的 ;后者 外源蛋白不是表面展示 ,而是与一些标志蛋白如谷 胱甘肽还原酶 GST等一起进行融合表达 。 2 技术背景
此外 ,利用非丝状噬菌体的许多其他展示系统 也逐步发展起来 。包括融合到 λ噬菌体尾部蛋白 Ⅴ[ 12 ]和衣壳蛋白 D[ 13, 14 ] 的展示系统 , T4 噬菌体展 示系统 [ 15 ] 以及 T7 噬菌体展示系统 [ 16, 17 ] 库的构建系统 3. 1 M 13噬菌体展示系统
物在噬菌体组装前需要分泌的问题 [ 7 ] 。任何与衣 壳蛋白融合的 cDNA 基因产物 ,只要它的一些特性 阻止其跨膜就不会被分泌出去 ,也就不会组装到噬 菌体衣壳中 ,这显然对分泌性蛋白质有利 。因此 , M13作为噬菌体展示工具时 ,胞内蛋白 、核蛋白等就 不会被分泌出去 ,在筛选时则易产生偏差 ,分泌性是 M13最主要问题之一 。例 如 :基于 c2Fos和 c2Jun亮氨酸拉链而形成异二聚体 的 PJUFo系统 [ 8, 9 ]及外源蛋白融合到 M13 p Ⅵ衣壳 蛋白羧基末端的展示系统 [ 10, 11 ] 。这两种展示系统 能够缓解 M13 展示系统遇到的翻译终止密码子难 题。
λ噬菌体的最的 组装发生在宿主菌的细胞质内 ,因此不需要融合蛋 白质分泌出去 ,并且适合把目的 cDNA 片段插入到 编码衣壳蛋白 D 基因的 3′末端 ,这就允许克隆全长 的 cDNA 产遇到的有关翻译 终止密码子和蛋白分泌方面的两个难题 。
© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
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国际医学寄生虫病杂志 2007年 3月第 34卷第 2期 Int J Med Parasit D is,Mar 2007, Vol. 34, No. 2
以 p Ⅲ为基础的展示系统最突出的特点是对外 源多肽或蛋白质的大小无严格限制 ,已成功展示相 对分子质量 (M r)大至 50 000的蛋白质 ,且可筛选到 高亲合力的受体 。然而 ,由于 cDNA 片段羧基末端 含有终止密码子 ,使得与 M13 噬菌体的 p Ⅲ不可能 和 p Ⅷ衣壳蛋白的 N 端融合 。 c2Fos和 c2Jun之间形 成亮氨酸拉链 ,从而在 p Ⅲ产物与表面表达的 cDNA 产物之间提供一个共价连接即可解决该问题 。在噬 菌体 PComb3的基础上 ,结合 c2Fos和 c2Jun之间能 够形成稳定的氨基酸拉链 , C ram eri等 [ 19, 20 ] 构建了 一个名为 PJUFo的崭新的展示系统 。在 PComb3的 构建策略里 ,包含 2个独立的乳糖启动子 ,其后分别 紧挨着 PelB 信号肽序列 。Crameri等在 2 个信号肽
应用最多的是在 λ噬菌体头部蛋白 D 的 3′末 端插入目的基因 。 1998 年 , Santini等 [ 18 ] 利用载体 λpRH8示在噬菌体表 面 。基于 D 端融合且质粒载体包含一细胞中 ,这些细胞又被带有 Loxp 位点 的 λed ica l U n iversity, N an jing 210029, Ch ina
Correspond ing au thor: WU Ha i2w ei, E2m a il: ha iw ei@ n jm u. edu. cn 【Abstract】 The p rincip les and development of phage disp lay of cDNA library are elucidated here, as