激光扫描共聚焦显微镜技术

激光扫描共聚焦显微镜技术
激光扫描共聚焦显微镜技术
Laser Scanning Confocal Microscope
——基础篇
李治国
细胞的内在⽣活
显微镜的发展史
没有显微镜就不可能有细胞学诞⽣。

1590年，荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen⽗⼦制作了第⼀台复式显微镜。

1665年，英国⼈Robert Hook⾸次描述了植物细胞(⽊栓)，命名为cella。

1680年，荷兰⼈A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他⼀⽣中制作了200多台显微镜和400多个镜头，⽤设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原⽣动物。

Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723).
Magnification ranges at 50-275x.
显微镜的最重要参数
——分辨⼒
显微镜物象是否清楚不仅决定于放⼤倍数，还与显微镜的分辨⼒（resolution）有关。

分辨率是指区分开两个质点间的最⼩距离
各种显微镜的分辨能⼒
光学显微镜（light microscopy）0.2µm
电⼦显微镜 (Electro microscopy) 0.2nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 0.2nm以下1932年，德国⼈M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨⼒为0.2nm的商品电镜。

1981年，瑞⼠⼈G.Binnig和H.RoherI在IBM苏黎世实验中⼼（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜⽽与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。

常⽤的光学显微镜（light microscopy)
普通光学显微镜
暗视野显微镜
相差显微镜
偏光显微镜
微分⼲涉显微镜
荧光显微镜
激光共焦扫描显微镜
普通光学显微镜原理
普通光学显微镜原理图
1. 构成：
①照明系统
②光学放⼤系统
③机械装置
2. 原理：经物镜形成倒⽴实像，经⽬镜放⼤成虚像。

暗视野显微镜
根据丁达尔效应原理设计的⼀种在⿊⾊背景条件下观察被检物体的显微镜
观察到明场看不到的极其微⼩的物体
最⾼分辨率可达0.004微⽶
1 原理
丁达尔现象：在⽇常⽣活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有⼀束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒的散射光。

暗视野显微镜就是利⽤微粒的散射光原理设计的。

2 结构特点
使⽤中央遮光板或暗视野聚光器（常⽤的是抛物⾯聚光器），使光源的中央光束被阻挡。

不能由下⽽上地通过标本进⼊物镜。

从⽽使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发⽣反射或散射，散射的光线投⼊物镜内，因⽽整个视野是⿊暗的。

暗场显微镜原理
3成像特点
在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并⾮物体本⾝，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。

但被检物体为⾮均质时，并⼤于1／2波长，则各级衍射光线同时进⼊物镜，在某种程度上可观察物体的构造。

⼀般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最⼤的分辨⼒
为0.2um)所不具有的特性，可⽤以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

4 应⽤：微⼩粒⼦、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。

5 暗场显微镜的要求
要求载玻⽚和盖玻⽚必须⽆疵痕和灰尘
物镜前透镜必须清洁⽆尘
载玻⽚和盖玻⽚厚度必须绝对符合要求
6暗场观察⽅式调节
(1)换上暗场聚光镜（⼲燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表⾯滴上镜头油。

向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻⽚底⾯相接触后。

(2)将视场光阑适当缩⼩，⽤10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。

上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。

(3)视场光圈如不在视野中央，可利⽤聚光镜外侧两个调节螺丝进⾏调整，再将其开⼤到相应位置。

⼈的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜⾊不同（光的波长不同），但难以识别差别⼩的⽆⾊的透明物体。

光对⽆⾊透明物体（相位物体）并不引起明、暗和颜⾊的变化，⽽只产⽣所谓的相位差。

可是这种相位差不能⽤⾁眼识别，也就看不见这种相位物体了。

相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从⽽提⾼了各种结构间的对⽐度，使各种结构变得清晰可见。

光线透过标本后发⽣折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为
1/2λ，两束光合轴后⼲涉加强，振幅增⼤或减下，提⾼反差。

相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利⽤光的衍射和⼲涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增⼤其明暗的反差。

因此可⽤以观察活细胞或未染⾊标本。

环状光阑是由⼤⼩不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。

在更换不同倍率的相差物镜时，每⼀次都要使⽤相匹配的环状光阑。

⽤于观察组织培养中活细胞形态结构。

活细胞⽆⾊透明，⼀般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常⽤的是倒置相差显微镜。

偏光显微镜
依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的⼀种显微镜分辨率可达0.04微⽶将普通光改变为偏振光进⾏镜检,以鉴别某⼀物质具有单折射性(各向同性)或双折射性(各向异性)偏振光与⾃然光
1. 横波的偏振性
光⽮量的振动⽅向总与光的传播⽅向垂直，在垂直于光传播⽅向的平⾯内, 可有不同的振动⽅向。

2.线偏振光--光⽮量只在某⼀固定的⽅向上振动。

⼆、起偏和检偏
起偏：使⾃然光（或⾮线偏振光）变成线偏振光的过程。

检偏：检查⼊射光的偏振性的过程。

双折射现象：⼀束光射⼊各向异性晶体后有两束折射光的现象。

尼科⽿棱镜。

在⽣物样品中，肌⾁纤维、⾻骼和⽛齿等具有各向异性，淀粉粒、染⾊体和纺锤体等具有双折射性，因此被⽤于组织细胞的化学研究。

寻常光线(o光):遵守折射定律。

对于晶体⼀切⽅向都具有相同的折射率，且在⼊射⾯内传播。

⾮常光线(e光):不遵守折射定律。

它的折射率随⽅向⽽变化，并且不⼀定在⼊射⾯内传播。

o光和e光都是线偏振光,且振动⽅向相互垂直
⼆向⾊性：某些晶体（电⽓⽯、硫酸⾦鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能⼒，这种性质称为⼆向⾊性。

如电⽓⽯晶体对⾃然光的某⼀振动⽅向上的光振动⼏乎完全吸收，⽽垂直于该⽅向的光振动只稍微减弱后通过。

旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动⽅向将绕着光的传播⽅向旋转某⼀⾓度的现象，称为旋光现象。

这种介质称为旋光物质。

如⽯英、糖、酒⽯酸钾钠等。

微分⼲涉显微镜
⽆⾊透明活体标本的细微结构
图象呈浮雕状的⽴体感
观察效果更加逼真
1 原理
通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，
光束载极近的两点（⼩于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从⽽在相位上略有差别，使图象呈现出⽴体三维感觉。

2 特点
可以使被检物体产⽣三维⽴体感觉
观察效果更直观
⽆须特殊物镜，与荧光观察配合更好
可以调节背景和物体的颜⾊变化⽽达到理想的效果。

荧光显微镜 Fluorescence microscope
特点：光源为短波光，信噪⽐⾼
荧光显微镜
⼀、原理
荧光显微镜是利⽤⼀个⾼发光效率的点光源，经过滤⾊系统发出⼀定波长的光(如紫外光3650⼊或紫蓝光4200⼊)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜⾊的荧光后，再通过物镜和⽬镜的放⼤进⾏观察。

这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性⾼，主要⽤于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上⼀些附件(如荧光光源、激发滤⽚、双⾊束分离器和阻断滤⽚等)的基础上组成的。

荧光显微镜 Fluorescence microscope
特点：光源为短波光，信噪⽐⾼
荧光光源⼀般采⽤超⾼压汞灯(50⼀200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有⼀个产⽣最强荧光的激发光波长，所以需加⽤激发滤⽚（⼀般有紫外、紫⾊、蓝⾊和绿⾊激发滤⽚），仅使⼀定波长的激发光透过照射到标本上，⽽将其他光都吸收掉。

每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。

荧光具有专⼀性，⼀般都⽐激发光弱，为能观察到专⼀的荧光，在物镜后⾯需加阻断滤光⽚。

它的作⽤有⼆：⼀是吸收和阻挡激发光进⼊⽬镜、以免⼲扰荧光和损伤眼睛。

⼆是选择并让特异的荧光透过，表现出专⼀的荧光⾊彩。

两种滤光⽚必须选择配合使⽤。

荧光显微镜⽤途
1 观察标本中的⾃发荧光物质或以荧光素染⾊或标记的细胞和结构
2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产⽣各种颜⾊的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。

组织中的⾃发性荧光物质如神经细胞和⼼肌细胞等内的脂褐素呈棕黄⾊荧光，肝贮脂细胞和视⽹膜
⾊素上⽪细胞内的维⽣素A呈绿⾊荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（⼉茶酚胺、5－羟⾊胺、组胺等）在甲醛作⽤下呈不同颜⾊的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现⼀定的荧光。

3 细胞内的某些成分可与荧光素结合⽽显荧光，如溴化⼄锭与吖啶橙可与DNA综合，进⾏细胞内DNA含量测定。

4 荧光显微镜更⼴泛⽤于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（⼀抗或⼆抗），⽤该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。

⽤于观察能激发出荧光的结构。

⽤途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

缺点分辨⼒不⾼
激光共焦扫描显微镜
（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）
LSCM的基本结构、⼯作原理
荧光探针的选择原则
LSCM在⽣物医学领域中的应⽤
激光共聚焦扫描显微镜简介
80年代研发的新型显微镜
以荧光显微镜成象原理为基础
采⽤激光扫描装置，利⽤计算机⽣成图象
得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞⽔平上观察细胞，还能显⽰诸如Ca2+、pH值、膜电位等⽣理信号及细胞形态的变化。

发展史
1、20世纪50年代中期提出。

Marvin Minsky在哈佛⼤学博⼠后⼯作期间，提出了共聚焦显微镜的基本概念，并于1957年申请了技术专利。

Minsky的发明并没有马上引起⼈们的注意，主要原因是没有⾜够强度的光源，并且当时计算机的能⼒还不⾜以处理⼤量的数据。

2、90年代发展成熟。

随着光学和电⼦技术的发展产⽣了更稳定和更强的激光、更⾼效的扫描镜⽚组、⾼效能的光纤、更精细的镀膜技术和更低噪⾳的检测器。

更多适合激光激发的荧光染料不断被合成。

相应的计算机处理器速度快速发展，图像显⽰技术增强和⼤容量的存储设备的产⽣，推动了激光扫描共聚焦显微镜迅速普及。

2006年购⼊OLYMPUSFV1000，耗资18.7万美元。

激光扫描共聚焦显微镜结构和⼯作原理
⽬标要求
1.掌握激光扫描共聚焦显微镜技术的⼯作原理。

2.熟悉激光扫描共聚焦显微镜的结构。

3.了解激光产⽣的原理。

4.了解激光扫描共聚焦显微镜的功能。

⼀、基本组成
（⼀）激光器:多线氩离⼦(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633 nm)
（⼆）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单⾊器及检测器)、荧光显微镜(装有微量步进马达)系统，实现点光源在样品上逐点逐层扫描成像
（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、⼤⼩及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电⼦放⼤倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。

（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全⾃动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进⾏定量测定。

⼆、激光器激光产⽣的原理
（1）受激吸收
激光器的结构
激光⼯作介质
在这种介质中可以实现粒⼦数反转，以制造获得激光的必要条件。

激励源
通过⼀定的⽅式使处于⾼能级的粒⼦数增加。

包括电激励，光激励，热激励、化学激励等⽅法。

谐振腔
光在谐振腔中来回振荡，造成连锁反应，雪崩似的获得放⼤，产⽣强烈的激光，从部分反射镜⼦⼀端输出。

三、扫描器
四维扫描模式
激光扫描共焦显微镜的发展趋势
多光⼦激光扫描显微镜—Multiphoton Laser Scanning Microscopy
在⽣物及医学成像,单分⼦探测,三维信息存储,微加⼯等领域得到⼴泛应⽤,展⽰了⼴阔的发展前景.
多光⼦激光扫描显微镜简介
1.多光⼦激光器波长从700-1000nm连续可调
双光⼦波长：350-500nm 连续
三光⼦波长：230-330nm 连续
应⽤：可直接清晰活体观察某些⾮标记神经递质的分泌 (5-HT) 或NADPH的分布
多光⼦激光扫描显微镜优点与局限:
优点:
1 对⽣物样品的光损伤⼩
2 有效观测时间长
3 穿透深度深
4 荧光收集率⾼
5 对探测光路的要求低
6 适合多标记复合测量
局限:
1 只能对荧光成像
2 样品可能受到热损伤.(若样品含吸收激发光的⾊团,如⿊⾊素)
3 超快激光器较为昂贵
四、激光共聚焦扫描显微镜技术特点
激光光源
逐点、逐⾏、逐⾯快速扫描被激发荧光成像
共聚焦：扫描的激光与荧光收集共⽤⼀个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点
五、激光共聚焦扫描显微镜技术优点
⽤激光做光源因为激光的单⾊性⾮常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了⾊差。

采⽤共聚焦技术在物镜的焦平⾯上放置了⼀个当中带有⼩孔的挡板,
将焦平⾯以外的杂散光挡住,消除了球差;并进⼀步消除了⾊差
采⽤点扫描技术将样品分解成⼆维或三维空间上的⽆数点,⽤⼗分细⼩的激光束(点光源)逐点逐⾏扫描成像,再通过微机组合成⼀个整体平⾯的或⽴体的像。

⽽传统的光镜是在场光源下⼀次成像的,标本上每⼀点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的⼲扰。

这两种图像的清晰度和精密度是⽆法相⽐的。

⽤计算机采集和处理光信号,并利⽤光电倍增管放⼤信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了⼈眼或照相机进⾏观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进⾏处理,再⼀次提⾼图像的清晰度。

⽽且利⽤了光电倍增管,可以将很微弱的信号放⼤,灵敏度⼤⼤提⾼。

由于综合利⽤了以上技术。

可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。

五、激光共聚焦扫描显微镜应⽤优势
半定量分析⽅便。

激光共聚焦扫描显微镜既可以⽤于观察细胞形态，也可以⽤于细胞内⽣化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。

分辨率⾼。

由于激光束的波长较短，光束很细，排除焦平⾯以外光的⼲扰，所以共焦激光扫描显微镜有较⾼的分辨⼒，⼤约是普通光学显微镜的3倍。

可重构样品的三维结构。

系统经⼀次调焦，扫描限制在样品的⼀个平⾯内，调焦深度不⼀样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显⽰细胞样品的⽴体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。

可连续摄像
六、LSCM的功能
1.获取透射光、反射光及荧光图像，能进⾏定性及定位分析及图像处理
2.⽆损伤、连续光学切⽚，显微“CT”
及三维重组
3.连续摄像
4.光谱扫描
激光扫描共聚焦显微镜
荧光探针的选择
学习⽬标
1.了解荧光产⽣的原理。

2.掌握荧光淬灭的概念及影响荧光淬灭的因素。

3.熟悉常⽤的荧光探针。

4.了解荧光样品的制备过程。

（⼀）荧光
⼀些物质原⼦受光照射时，能吸收⼊射光⼦的能量，使其电⼦从低能级向较⾼能级跃迁，处于这种激发态的分⼦不稳定，电⼦可通过跃迁的形式发射可见光⼦，放出多余的能量⽽返回基态，这种放出先前所吸收能量的可见光，即荧光。

荧光在停⽌激发的时候发光在10-7-10-8s 内停⽌。

可见：荧光是发射光。

即：物质吸收短波光，发射出的长波光。

荧光的种类：
⾃发荧光（固有荧光）
⼆次荧光
3.荧光探针的⽤途：
1.蛋⽩质、单糖和多糖探针
2.细胞器探针
3.核酸探针
4.细胞活性探针
5.膜和受体探针
6.细胞膜电位和细胞内pH探针
7.⾦属离⼦探针
8.分⼦的特殊基团结合探针和其它
⼆、荧光样品的制备过程
（⼀）荧光标记前样品的准备
组织标本：活的组织切⽚、冰冻切⽚和固定切⽚
细胞标本：爬⽚、穿刺液涂⽚、液体沉淀涂⽚
在保证形态完整、达到试验⽬的的情况下，切⽚厚度越薄越好，⼀般为4-35µm
（⼆）⽤荧光探针标记样品
1.荧光探针的储存和配制
⼀般按产品说明书要求，避免反复冻融。

⼯作液现⽤现配。

2.正确溶解荧光探针
荧光探针的充分溶解是很重要的。

常⽤溶剂甲醇、⼄醇、DMSO、⽔（⽣理盐⽔）缓冲液等。

储存液中荧光探针的浓度⼀般为10-1000µm。

注意：
a.甲醇、⼄醇低沸点、易挥发，使⽤时防⽌其挥发造成探针浓度浓缩和⼲燥。

b.DMSO易凝固，要在25℃以上待其充分融化以后再⽤于溶解荧光探针。

c.对于难溶解的荧光探针，可考虑⽤超声溶解。

3. 确定荧光探针标记待测样品的条件
影响胞内荧光探针浓度及分布的因素可分为两类：
a.由细胞本⾝决定的因素，如细胞种类、活性、膜表⾯积结构和⼤⼩、细胞内成分和结构等。

b.染⾊条件，如初始的细胞外染料浓度及细胞浓度、荧光探针与细胞孵育时的时间、PH、温度、接触⾯积、溶剂的极性、共存物质的种类等。

4.荧光染⾊⽅法：
(1)⽣物样品与荧光探针（或其衍⽣物）直接结合，使样品具有荧光。

许多荧光探针是疏⽔性的，很难或不能进⼊细胞。

可以⽤⼄酰羟甲基酯(AM)作为载体，将探针运送⼊细胞。

荧光探针与AM结合后变成不带电荷的亲脂性化合物，易于通过质膜进⼊细胞。

之后细胞内的AM被⾮特异性酯酶⽔解释放出荧光探针，由于探针的疏⽔性使其不易透出质膜。

荧光探针与细胞内的靶结构或靶分⼦结合，从⽽能有效的发挥作⽤。

例如：Fluo-3就需要AM 的辅助
(2) 显微注射法：该法复杂精细，⽽且得到荧光的细胞少。

例如：膜⽚钳导⼊法、微量电泳注射法、压⼒注射法
(3) 膜通透法增强探针跨膜能⼒例如：透膜剂、低渗培养液或低pH 培养液短期刺激。

(4)⾸先⽤荧光探针将某些特定的分⼦标记，这些特定分⼦再与样品作⽤，通过检测细胞内荧光强度和位点，达到测定细胞内靶分⼦的含量及其定位的⽬的。

例如：免疫荧光法、荧光标记的药物及蛋⽩的跨膜研究，尤其是间接免疫荧光法更为常⽤。

⼆、荧光样品的制备注意事项
依据试验⽬的选择合适的荧光探针及染⾊策略
例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进⼊细胞标记DNA，也可以标记死细胞；⽽PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防⽌⾮特异性标记。

合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。

荧光强度适宜、具有可重复性。

注意荧光稳定性
光敏效应弱：主要表现为在光的作⽤下，荧光探针发⽣荧光淬灭或增强。

照射光强度越⼤、波长越短，则光敏现象越严重。

例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，⽽DCFH则会发⽣荧光增强。

环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等）样品中多重荧光之间的相互影响
光漂⽩性：激发光的强度超过⼀定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分⼦。

图像背景低、⾮特异性染⾊少
尽早上机采集图像。

防⽌荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞⼲燥等导致的荧光变化。

重点内容回顾
荧光探针的⽤途：
1.蛋⽩质、单糖和多糖探针
2.细胞器探针
3.核酸探针
4.细胞活性探针
5.膜和受体探针
6.细胞膜电位和细胞内pH探针
7.⾦属离⼦探针
8.分⼦的特殊基团结合探针和其它
荧光样品的制备注意事项
依据试验⽬的选择合适的荧光探针及染⾊策略
例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进⼊细胞标记DNA，也可以标记死细胞；⽽PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防⽌⾮特异性标记。

合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。

荧光强度适宜、具有可重复性。

注意荧光稳定性
光敏效应弱：主要表现为在光的作⽤下，荧光探针发⽣荧光淬灭或增强。

照射光强度越⼤、波长越短，则光敏现象越严重。

例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，⽽DCFH则会发⽣荧光增强。

环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等）样品中多重荧光之间的相互影响
光漂⽩性：激发光的强度超过⼀定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分⼦。

图像背景低、⾮特异性染⾊少
尽早上机采集图像。

防⽌荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞⼲燥等导致的荧光变化。

荧光探针的⽤途：
1.蛋⽩质、单糖和多糖探针
2.细胞器探针
3.核酸探针
4.细胞活性探针
5.膜和受体探针
6.细胞膜电位和细胞内pH探针
7.⾦属离⼦探针
8.分⼦的特殊基团结合探针和其它
/doc/6fbe026b011ca300a6c3908a.html
荧光样品的制备注意事项
依据试验⽬的选择合适的荧光探针及染⾊策略
例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进⼊细胞标记DNA，也可以标记死细胞；⽽PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防⽌⾮特异性标记。

合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。

荧光强度适宜、具有可重复性。

注意荧光稳定性
光敏效应弱：主要表现为在光的作⽤下，荧光探针发⽣荧光淬灭或增强。

照射光强度越⼤、波长越短，则光敏现象越严重。

例
如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，⽽DCFH则会发⽣荧光增强。

环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等）样品中多重荧光之间的相互影响
光漂⽩性：激发光的强度超过⼀定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分⼦。

图像背景低、⾮特异性染⾊少
尽早上机采集图像。

防⽌荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞⼲燥等导致的荧光变化。

激光扫描共聚焦显微镜的应⽤
（⼀）细胞或组织内核酸的定位、定性
荧光探针分⼦与核酸的结合基本上有三种⽅式:嵌⼊式结合⽅式、结构亲和⽅式、以共价键⽅式结合
1.常⽤核酸染料包括花青类和经典核酸染料两⼤类。

1) 花青染料包括: 核酸超敏定量和凝胶染⾊的染料，细胞⾮通透性的TOTO、TO-PRO、SYTOX染料家族，细胞通透性的SYTO 染料家族，能⽤来形成⽣物交联物的化学反应性SYBR染料。

2) 经典核酸染料包括：插层染料, 如溴化⼄锭和碘化丙啶(propidium iodide)PI；⼩沟结合剂, 如DAPI和Hoechst染料；不同性质的核酸染料，包括吖啶橙(AO)、7-AAD、LDS 751和羟基芪脒(hydroxystilbamidine), 各具有特殊性质。

图⽰活的⽜肺动脉内⽪细胞与细胞通透性的淡兰⾊荧光⼆氢⼄锭和绿⾊荧光线粒体染料
图⽰DAPI与DNA结合的X-线晶体结构。

X-线晶体学显⽰DAPI与DNA在⼩沟结合。

DAPI是出⾊的核复染剂，可显⽰出清楚的染⾊体显带图案
（⼆）蛋⽩质的定位、定性
免疫荧光
直接免疫荧光
间接免疫荧光
绿⾊荧光蛋⽩
免疫学中抗原抗体知识回顾
常见的以免疫学为基础的分析⽅法
⼀、免疫组化
⼆、pull down
三、免疫共沉淀
四、酶联免疫吸附（ELISA）
五、western blot
六、激光共聚焦
七、流式细胞仪分析
等等。

抗体的常见标记
单克隆抗体和多克隆抗体
单抗与多抗的区别
单抗多抗
抗体组成单⼀复杂
抗体性质个体的属性群体综合的性质
纯化标记容易，效果好难度⾼⼀些
种属来源绝⼤多数是⼩⿏兔⼦、⽺、豚⿏等
制备周期长 (最短4个⽉）短（2个⽉）
制备技术复杂简单
经费多少
抗原决定簇
1、概念抗原决定簇（antigenic determinant, AD)是指抗原中决定抗原特异性的特殊化学基团，⼜称为表位（epitope)。

表位的性质、数⽬和空间构象决定着抗原的特异性。

抗原通过AD与相应淋巴细胞表⾯的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。

2、种类和数量⼀个抗原分⼦可以有⼀种或多种不同的AD ，⼀种AD 决定着⼀种特异性，多种AD决定着多种特异性
3、部位位于抗原表⾯的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决定簇，存在抗原分⼦内部的AD⽆激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。

只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。

顺序决定簇和构象决定簇
顺序决定簇（线性决定簇）：
⼀段序列相连的氨基酸⽚段形成
多在抗原分⼦内
主要由T识别，B也可识别
构象决定簇：
序列上不相连，由天然构象形成
位于分⼦内部
由B识别
功能决定簇和隐蔽决定簇
功能性抗原决定簇：位于表⾯的、易被抗体及淋巴细胞识别的、可启动免疫应答的决定簇的免疫优势集团
隐蔽性抗原决定簇：为于分⼦内部的，不能引起免疫应答的决定簇
功能决定簇和隐蔽决定簇
氨基酸残基在侧链的位置不同，其免疫原性不同。

抗原抗体反应的原理
抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发⽣的特异性结合反应。

物质基础:
抗原表位与抗体⾼变区间的互补结合
抗原表位与抗体⾼变区的沟槽分⼦表⾯的结合
抗原抗体之间的结合⼒
电荷引⼒（静电引⼒）
范登华引⼒
氢键结合⼒
疏⽔作⽤⼒
1. 电荷引⼒（库伦引⼒或静电引⼒）:。