【检验】植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法编制说明
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提取样品DNA后，通过普通PCR或实时荧光PCR技术对样品DNA进行筛选基因或结构基因特异性片段扩增，根据PCR扩增结果电泳图或实时荧光扩增曲线，判断该样品中是否含有转基因成分。
对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系筛查和确证，则采用品系特异性普通PCR或实时荧光PCR，特异性扩增上述品系特异性片段，根据PCR扩增结果（电泳图或实时荧光扩增曲线），判定该样品中含有哪（些）种转基因油菜品系成分。
2.2与国内外相关标准、文献的关系
引用国际国内已发布的权威标准方法，属于标准等同采用。
3编制过程
3.1准备阶段（可选项）
3.2分工情况
中国检科院负责标准总体方案设计及标准草案，山东出入境检验检疫局负责转基因产品通用元件检测方法的收集，上海出入境检验检疫局负责转基因品系检测方法的收集，分工协作，保证了该标准的顺利完成。
CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。
dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。
dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。
dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。
SDS：sod
Taq：TaqDNApolymerase，DNA聚合酶。
TE：Tris-HCl、EDTA缓冲液。
tNOS：terminator of nopaline synthase gene fromAgrobacterium tumefaciens，来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求
GB/T 19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法
GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法
下列术语、定义和缩略语适用于本标准。
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。
BARSTAR：specific inhibitor of the barnase gene fromBacillus amyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的BARNASE基因的特异抑制基因。
BXN：nitrilase enzymegene fromKlebsiella pneumoniae subsp. Ozaenae，来源于肺炎克雷伯杆菌臭鼻亚种的腈水解酶基因。
【关键字】检验
附件7：
出入境检验检疫行业标准草案编制说明（参照格式）
1基本信息
1.1标准草案名称
中文
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
英文
Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified plants and their derived products
PE3-PEPcase：Phosphoenilpyruvate-Carboxylase，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
tRNALeu：植物叶绿体基因。
18s rRNA:真核生物18s核糖体RNA基因。
CaMV 35S：35S promoter from Cauliflower mosaic virus，来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子。
1.2与国际标准和国外先进标准一致程度情况
□等同
□修改
☑非等效
标准号
英文名称
Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified plants and their derived products
中文名称
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
NOS：Terminator of nopaline synthase gene，胭脂碱合成酶基因终止子。
FMV35S：35S promoter from a modified figwort mosaic virus (caulimovirus group)玄参花叶病毒35S启动子。
NPTII：Neomycin-3'-phosphotransferase gene，新霉素-3’-磷酸转移酶基因。
1.3任务来源
批准立项的文件名称和文件号
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
计划编号
2011B477r
1.4制（修）订情况
□制定
☑修订
替代的标准编号
SN/T 1204-2003
1.5起止时间
2012年12月---2013年12月
1.6项目承担单位
中国检科院
1.7起草团队
中国检科院，山东出入境检验检疫局，上海出入境检验检疫局
除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
称取121.1gTris,溶于800mL水中，搅拌，加入浓盐酸42mL,冷却至室温，用稀盐酸准确调整pH至8.0，分装后高压灭菌备用。
在800mL H2O中加入186.1gNa2-EDTA·2H2O,在磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节溶度pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
3.3标准草案编写情况
该标准草案的编写主要按照格式要求，撰写核酸提取方法、定性方法、检测的引物探针和体系以及检测的质量控制和结果判断方法等内容来编写。
3.4征求意见情况（适用于送审稿）
3.5审定情况
（适用于报批稿）
3.6预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）
4主要技术内容的确定
Tris：tris (hydroxymethyl) aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。
UDG：uracil DNA glycosylase，尿嘧啶DNA-糖基酶。
UNG酶：uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶。
Lectin：植物凝集素。
ADH：alcohol dehydrogenase乙醇脱氢酶。
DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。
dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。
dUTP：deoxyuridine triphosphate，脱氧尿苷三磷酸。
EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。
GOX：Glyphosate oxidoreductase gene草甘膦氧化还原酶基因。
CryIA(b)：Asynthetic gene encodes the first 648 amino acids, insecticidal-active ftruncated product identical to that of cryIA(b) gene of Bacillus thuringiensis subsp。苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA(b)基因。
EPSPS：5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthasegene5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因。
BAR：phosphinothricin acetyltransferase gene，磷化麦黄酮乙酰转移酶基因。
BARNASE：ribonuclease gene fromBacillus amyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因。
pNOS：promoter of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子。
pTA29：developmentally regulated promoter from anther-specific TA29 gene fromNicotiana tabacum，来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动子。
PEP：phosphoenolpyruvate carboxylasegene，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。
pCaMV 35S：35S promoter from cauliflower mosaic virus，花椰菜花叶病毒35S启动子。
pFMV 35S：35S promoter from a modified figwort mosaic virus，玄参花叶病毒35S启动子。
Cru A：CruciferinAgene，油菜种子储藏蛋白基因。
GOX：glyphosate oxidoreductase gene，草甘膦氧化还原酶基因。
HMGI/Y：Highmobilitygroup proteingene，高移动性蛋白家族基因。
NPTII：neomycin-3'-phosphotransferase gene，新霉素-3’-磷酸转移酶基因。
bp：base pair，碱基对。
PAT：phosphinothricinacetyltransferase gene fromBacillus amyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的草丁膦乙酰转移酶基因。
PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。
实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量。
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。
利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
1.8专业类别
□食品（化妆品）检验；□卫生检疫；□动物检疫；☑植物检疫；
□纺织产品检验；□轻工产品检验；□机电产品检验；□化工、矿产品和金属材料检验；□管理；□鉴定；□包装及危险化学品
1.9标准体系表代码
1.10调整情况
无调整
2背景情况
2.1目的、意义
原标准是10年前制定的，2003年，全球转基因作物种植面积只有8亿公顷，至2012年，种植面积达1.7亿公顷，全球59个国家或地区批准了2497项申请，涉及25种作物319个转化体。转基因产品呈现出生物技术产品品种多、性状全、成分复杂等新特点，原有标准所涉及的检测方法远远无法满足日常转基因检测的需求。具体存在的问题有，1、转基因筛查用通用元件有很大的发展，急需补充完善相应的检测方法；2、原有标准中的一些检测方法有更新，可采用更先进更灵敏的检测方法；3、品系检测是目前转基因鉴定的重点，原标准中尚未涉及，需制定系统覆盖我国主要进出口作物的品系检测方法；4、现有的标准检测方法较分散，在实际的检测操作中带来很大的不便。基于上述背景，本标准拟制定一项内容全，适用面广，可操作性强、灵敏度高的转基因植物及其产品检测方法。
量取100mL 1mol/L Tris·HCl, 50mL 0.5mol/LEDTA·Na,称取5.0gSDS，16.848gNaCl，定容至1L，分装后高压灭菌备用。
量取10 mL 1mol/L Tris·HCl和2mL 0.5mol/LEDTA·Na,加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。
BAR：Phosphinothricin acetyltransferase genefrom Bacillus amyloliquefaciens来源于杆
菌Bacillus amyloliquefaciens草丁膦乙酰转移酶基因
PAT：Phosphinothricin acetyltransferase gene，草丁膦乙酰转移酶基因。
本标准规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于玉米、大豆、油菜籽、棉花、水稻及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR品系特异性检验或者其它检验方法检测结果为阳性的确证实验。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系筛查和确证，则采用品系特异性普通PCR或实时荧光PCR，特异性扩增上述品系特异性片段，根据PCR扩增结果（电泳图或实时荧光扩增曲线），判定该样品中含有哪（些）种转基因油菜品系成分。
2.2与国内外相关标准、文献的关系
引用国际国内已发布的权威标准方法，属于标准等同采用。
3编制过程
3.1准备阶段（可选项）
3.2分工情况
中国检科院负责标准总体方案设计及标准草案，山东出入境检验检疫局负责转基因产品通用元件检测方法的收集，上海出入境检验检疫局负责转基因品系检测方法的收集，分工协作，保证了该标准的顺利完成。
CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。
dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。
dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。
dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。
SDS：sod
Taq：TaqDNApolymerase，DNA聚合酶。
TE：Tris-HCl、EDTA缓冲液。
tNOS：terminator of nopaline synthase gene fromAgrobacterium tumefaciens，来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求
GB/T 19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法
GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法
下列术语、定义和缩略语适用于本标准。
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。
BARSTAR：specific inhibitor of the barnase gene fromBacillus amyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的BARNASE基因的特异抑制基因。
BXN：nitrilase enzymegene fromKlebsiella pneumoniae subsp. Ozaenae，来源于肺炎克雷伯杆菌臭鼻亚种的腈水解酶基因。
【关键字】检验
附件7：
出入境检验检疫行业标准草案编制说明（参照格式）
1基本信息
1.1标准草案名称
中文
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
英文
Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified plants and their derived products
PE3-PEPcase：Phosphoenilpyruvate-Carboxylase，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
tRNALeu：植物叶绿体基因。
18s rRNA:真核生物18s核糖体RNA基因。
CaMV 35S：35S promoter from Cauliflower mosaic virus，来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子。
1.2与国际标准和国外先进标准一致程度情况
□等同
□修改
☑非等效
标准号
英文名称
Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified plants and their derived products
中文名称
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
NOS：Terminator of nopaline synthase gene，胭脂碱合成酶基因终止子。
FMV35S：35S promoter from a modified figwort mosaic virus (caulimovirus group)玄参花叶病毒35S启动子。
NPTII：Neomycin-3'-phosphotransferase gene，新霉素-3’-磷酸转移酶基因。
1.3任务来源
批准立项的文件名称和文件号
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
计划编号
2011B477r
1.4制（修）订情况
□制定
☑修订
替代的标准编号
SN/T 1204-2003
1.5起止时间
2012年12月---2013年12月
1.6项目承担单位
中国检科院
1.7起草团队
中国检科院，山东出入境检验检疫局，上海出入境检验检疫局
除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
称取121.1gTris,溶于800mL水中，搅拌，加入浓盐酸42mL,冷却至室温，用稀盐酸准确调整pH至8.0，分装后高压灭菌备用。
在800mL H2O中加入186.1gNa2-EDTA·2H2O,在磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节溶度pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
3.3标准草案编写情况
该标准草案的编写主要按照格式要求，撰写核酸提取方法、定性方法、检测的引物探针和体系以及检测的质量控制和结果判断方法等内容来编写。
3.4征求意见情况（适用于送审稿）
3.5审定情况
（适用于报批稿）
3.6预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）
4主要技术内容的确定
Tris：tris (hydroxymethyl) aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。
UDG：uracil DNA glycosylase，尿嘧啶DNA-糖基酶。
UNG酶：uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶。
Lectin：植物凝集素。
ADH：alcohol dehydrogenase乙醇脱氢酶。
DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。
dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。
dUTP：deoxyuridine triphosphate，脱氧尿苷三磷酸。
EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。
GOX：Glyphosate oxidoreductase gene草甘膦氧化还原酶基因。
CryIA(b)：Asynthetic gene encodes the first 648 amino acids, insecticidal-active ftruncated product identical to that of cryIA(b) gene of Bacillus thuringiensis subsp。苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA(b)基因。
EPSPS：5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthasegene5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因。
BAR：phosphinothricin acetyltransferase gene，磷化麦黄酮乙酰转移酶基因。
BARNASE：ribonuclease gene fromBacillus amyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因。
pNOS：promoter of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子。
pTA29：developmentally regulated promoter from anther-specific TA29 gene fromNicotiana tabacum，来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动子。
PEP：phosphoenolpyruvate carboxylasegene，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。
pCaMV 35S：35S promoter from cauliflower mosaic virus，花椰菜花叶病毒35S启动子。
pFMV 35S：35S promoter from a modified figwort mosaic virus，玄参花叶病毒35S启动子。
Cru A：CruciferinAgene，油菜种子储藏蛋白基因。
GOX：glyphosate oxidoreductase gene，草甘膦氧化还原酶基因。
HMGI/Y：Highmobilitygroup proteingene，高移动性蛋白家族基因。
NPTII：neomycin-3'-phosphotransferase gene，新霉素-3’-磷酸转移酶基因。
bp：base pair，碱基对。
PAT：phosphinothricinacetyltransferase gene fromBacillus amyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的草丁膦乙酰转移酶基因。
PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。
实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量。
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。
利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
1.8专业类别
□食品（化妆品）检验；□卫生检疫；□动物检疫；☑植物检疫；
□纺织产品检验；□轻工产品检验；□机电产品检验；□化工、矿产品和金属材料检验；□管理；□鉴定；□包装及危险化学品
1.9标准体系表代码
1.10调整情况
无调整
2背景情况
2.1目的、意义
原标准是10年前制定的，2003年，全球转基因作物种植面积只有8亿公顷，至2012年，种植面积达1.7亿公顷，全球59个国家或地区批准了2497项申请，涉及25种作物319个转化体。转基因产品呈现出生物技术产品品种多、性状全、成分复杂等新特点，原有标准所涉及的检测方法远远无法满足日常转基因检测的需求。具体存在的问题有，1、转基因筛查用通用元件有很大的发展，急需补充完善相应的检测方法；2、原有标准中的一些检测方法有更新，可采用更先进更灵敏的检测方法；3、品系检测是目前转基因鉴定的重点，原标准中尚未涉及，需制定系统覆盖我国主要进出口作物的品系检测方法；4、现有的标准检测方法较分散，在实际的检测操作中带来很大的不便。基于上述背景，本标准拟制定一项内容全，适用面广，可操作性强、灵敏度高的转基因植物及其产品检测方法。
量取100mL 1mol/L Tris·HCl, 50mL 0.5mol/LEDTA·Na,称取5.0gSDS，16.848gNaCl，定容至1L，分装后高压灭菌备用。
量取10 mL 1mol/L Tris·HCl和2mL 0.5mol/LEDTA·Na,加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。
BAR：Phosphinothricin acetyltransferase genefrom Bacillus amyloliquefaciens来源于杆
菌Bacillus amyloliquefaciens草丁膦乙酰转移酶基因
PAT：Phosphinothricin acetyltransferase gene，草丁膦乙酰转移酶基因。
本标准规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于玉米、大豆、油菜籽、棉花、水稻及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR品系特异性检验或者其它检验方法检测结果为阳性的确证实验。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。