用CODEHOP设计简并引物克隆反刍月形单胞菌K6乙酸激酶基因片段

1 材料与方法
1. 1 菌株及培养液 反刍月形单胞菌 K6 由本课 题组从健康奶牛瘤胃中分离得到 。
培养液 :胰酶解酪蛋白 5. 0 g ,蛋白胨 5. 0 g ,酵 母提取物 10. 0 g ,牛肉浸膏 5. 0 g ,葡萄糖 5. 0 g , K2 H PO4 2. 0 g ,刃天青 1. 0 mg ,盐溶液 40 mL ,双馏 水 950 mL ,通入 N2 和 CO2 后煮沸 ,冷却后加入氯 化血红素溶液 10 mL ,维生素 K1 溶液 0. 2 mL , L2 半胱氨酸 0. 5 g ,调 p H 值至 7. 0 ,在 N2 条件下分 装 ,高压灭菌 。 1. 2 工具酶与生化试剂 Ex Taq 聚合酶 ( 5 U/ μL) ,DNA Marker ,dN TPs (2. 5 mmol/ L ) 均购自宝 生物工程 (大连) 公司 ; 总 DNA 提取试剂盒 、DNA 回收纯化试剂盒均购于杭州维特洁生物技术公司 ; 氯化血红素 、维生素 K 等购自 Sigma 公司 ,蛋白胨 、 酵母提取物购自 Oxoid 公司 。p MD182T 载体购自 宝生物工程 (大连) 有限公司 。 1. 3 主要数据库与软件 NCB I ( ht tp :/ / www . ncbi. nlm. nih. gov/ ) 、U nip rot 蛋白质序列查询数据 库 ( ht tp :/ / www . unip rot . org/ ) 、Blockemaker ( ht2 tp :/ / blocks. f hcrc. o rg/ blocks/ make_ blocks. ht2 ml ) 、Co de Hop ( ht tp :/ / blocks. f hcrc. org / blocks/ codehop . ht ml) 、M E GA 4. 0 。用 COD E HO P 检索 乙酸激酶简并引物时 ,检索主要设定参数为 “: Max2 imum core degeneracy :128 , Target clamp tempera2 t ure :60 ℃,codo n usage table :Bacillus subtilis”。 1. 4 序列比较 K6 的 16S rDNA 序列为本研究室 提交 ( GenBank 数据库上的登陆号为 DQ079866. 1) , 利用对 K6 16S rDNA 序列在 GenBank 中进行检索 同 源 rDNA 序 列 , 应 用 M E GA 软 件 中 Boot 2 st rap
3 Corres pon di n g aut hor , E2m ai l : li u g uow en2008 @163. com
乙酸激酶 (Acetate kinase) 是 A S KHA ( Acetate and Sugar Kinases , Hsp70 ,Actin) 磷酸转移酶超家 族中的成员 ,广泛存在于各类生物体内 ,负责催化乙 酰磷酸和 ADP 生成乙酸和 A TP 的可逆反应 ,在生 物体的 碳 源 代 谢 和 能 量 代 谢 中 发 挥 着 重 要 的 作 用[122] 。尤其对于生活在厌氧或微需氧环境 (如反刍
反刍月形单胞菌 ( S elenomonas rum i nanti um ) 系月形单胞菌属 ,是奶牛瘤胃内一种常见的革兰氏 阴性乳酸发酵菌[526] ,占瘤胃总细菌数的 50 %以上 , 是瘤胃正常的优势菌 ,是参与瘤胃发酵的重要瘤胃 微生物之一 ,并对反刍动物生糖先质丙酸的生成起 到重要作用 。反刍月形单胞菌基因组编码有乙酸激
test 的 邻 位 相 接 算 法 ( Neighbor2Joining ) , 运 算 1 000次构建不同菌种 rDNA 序列种系发生树 。 1. 5 简并引物的设计 根据种系发生树的进化关 系 ,在 U nip rot 和 NCB I 数据库中查找相应菌种的 乙酸激酶蛋白质序列 ,BlockMaker 服务器上对这些 序列进行块状比对 ,将比对结果递交到 COD E HO P 服务器进行运算 ,检索出乙酸激酶的简并引物 ,操作 流程见图 1 ,选用其中简并度小 、Tm 值及目的片段 长度合适的引物送公司合成 。
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中 国 兽 医 学 报 2010 年 1 月 第 30 卷 第 1 期 Chi n J V et S ci J an. 2010 Vol. 30 No. 1
用 CODEHOP 设计简并引物克隆反刍月形单胞菌 K6 乙酸激酶基因片段
逄晓阳1 ,2 ,刑 鑫1 ,刘国文1 3 ,王 哲1 (1. 吉林大学 畜牧兽医学院 动物营养代谢病与中毒病研究室 ,吉林
长春 130062 ;2. 国家农业深加工产品质量监督检验中心 ,吉林 长春 130022)
摘要 :利用 COD E HO P 设计细菌乙酸激酶的简并引物 ,选用 1 对引物 AC KSe 以高效丙酸生成菌反刍月形单胞菌 K6 基因组 DNA 进行 PCR ,得到 749 bp PCR 产物 ,产物经 p MD182T 载体克隆转化至 D H5α大肠杆菌中 ,测序后经 Blast x 比对 ,此 DNA 产物与其他菌属来源的乙酸激酶蛋白序列具有相似性 ,所克隆的序列即为 K6 的乙酸激酶基 因片段 。用 COD EHO P 程序化设计的简并引物可信性强 ,阳性率高 。该基因的成功克隆为丙酸生成菌 K6 乙酸代 谢工程研究提供了依据 。 关键词 :反刍月形单胞菌 ;COD EHO P ;乙酸激酶基因 中图分类号 :Q78 ; S8521 61 文献标识码 :A 文章编号 :100524545 (2010) 0120102205
本试验采用 COD E HO P ( Co nsensus degener2 ate hybrid oligo nucleotide p rimers) 在线软件程序 化设计反刍月形单胞菌乙酸激酶简并引物 ,以本实 验室从奶牛瘤胃中分离到的反刍月形单胞菌 K6 基 因组为模板 ,成功克隆出该菌乙酸激酶部分片段 ,该 基因片段的获得为利用 COD E HO P 方法克隆其他 瘤胃厌氧微生物乙酸激酶基因提供了一个新方法 , 也为远缘基因的克隆提供了一个有效的途径 。
图 1 用 COD EHO P 设计简并引物示意图
1. 6 简并扩增反刍月形单胞菌乙酸激酶序列 按 维特洁总 DNA 提取试剂盒说明书上的方法提取 K6 总 DNA ,用设计的简并引物 AC K Sr 进行扩增 。
PCR 反应体系为 50 μL : 10 × r Taq buffer 5 μL ,引 物 AC KSr2F 和 AC KSr2R 浓 度 均 各 为 50 p mol ,dN TPs 5 nmol ,DNA 5 ng ,r Taq 100 U 。PCR 反应 条 件 选 用 Touchdown PCR 法 : 95 ℃预 变 性 5 min ;然后 94 ℃变性 30 s ,从 61 ℃下降到 56 ℃退火 1 min ,每个循环降低 1 ℃,72 ℃延伸 1 min ,共 5 个循环 ; 接着按 94 ℃变性 30 s ,56 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 1 min ,共进行 25 个循环 ;最后在 72 ℃延伸 10 min。 1. 7 PCR 产 物 的 鉴 定 、回 收 、克 隆 及 测 序 以 11 0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定所得片段 ,利用杭州维特 洁公司的凝胶回收试剂盒回收目的片段 ,克隆过程 参照宝生物工程 (大连) 有限公司 p MD182T 试剂盒 说明书所述方法进行 。胶回收 DNA 与 p MD182T 载体 16 ℃连接过夜 ,转化大肠杆菌 D H5α,37 ℃培养 过夜 ,挑选白斑 PCR 鉴定 ,将阳性克隆送交上海生 物工程公司测序 。
收稿日期 :2009203介 :逄晓阳 (19802) ,男 ,博士研究生 。
3 通讯作者 , E2mail :liuguowen2008 @163. co m
动物瘤胃 ,深层矿岩) 下的低等原核生物来说 ,该酶 和磷酸乙酰转移酶 ( Pho sp hot ransacet ylase) 一起构 成了生物体生成乙酸过程的关键酶[3] ,同时该酶也 可以通过反应的中间体乙酰磷酸来调控体内其他生 物反应 ,在生物体内具有举足轻重的作用[4] 。
Abstract :Degenerate PCR fo r acetate of S elenomonas rumi nanti um K6 was earried o ut using COD EHO P to design t he degenerate p rimers ,cho seing a pair of degenerate p rimers named AC KSe and utilizing t he p ropionic acid p rodu2 cing bacteria genome DNA as template. 749 bp PCR p roduct was obtained , t ransformed into t he E. coli D H5α t hro ugh being linked wit h p MD182T vecto r and sequenced after filt ration. Similarity alignment showed t hat t he p rod2 uct s of t he cloned DNA were similar to t ho se of acetate kinase gene f rom t he ot her st rains. The cloned sequence was p utatively acetate kinase gene DNA f ragment f rom K6 st rain. The result s indicated t hat t he degenerate p rimers de2 signed by t he COD EHO P software co uld be used to o btain specific gene f ragment . Clo ning of gene f ragment would give a scientific warrant fo r t he metabolic engineering research of p ropio nic acid p roducing bacteria , S elenomonas ru2 mi nanti um K6. Key words : S elenomonas rumi nanti um ;COD E HO P ;acetate kinase gene
M et abol ic D iseases & T ox ico p at h y , Col le ge of A ni m al S ciences an d V eteri nar y M e dici ne , J i l i n U2 ni versi t y , Chan gchun 130062 , Chi na;2. Chi na N ational Q ual i t y S u perv ision Test Center f or P ro2 cesse d A g ricul t u ral Prod ucts , Chan gch un 130022 , Chi na)
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酶基因 ack ,在生物体乙酸生成过程中 ,乙酸激酶是关 键酶 ,它和磷酸乙酰转移酶一起控制着乙酸的最终生 成。所以 ,克隆反刍月形单胞菌乙酸激酶基因 ,研究 其在细菌产乙酸代谢途径中的生理生化作用 ,从而为 基因改造瘤胃微生物 ,调控瘤胃发酵提供依据 。
尤其对于生活在厌氧或微需氧环境如反刍动物瘤胃深层矿岩下的低等原核生物来说该酶和磷酸乙酰转移酶phosphotransacetylase一起构成了生物体生成乙酸过程的关键酶同时该酶也可以通过反应的中间体乙酰磷酸来调控体内其他生物反应在生物体内具有举足轻重的作用反刍月形单胞菌selenomonasruminantum系月形单胞菌属是奶牛瘤胃内一种常见的革兰氏阴性乳酸发酵菌526占瘤胃总细菌数的50以上是瘤胃正常的优势菌是参与瘤胃发酵的重要瘤胃微生物之一并对反刍动物生糖先质丙酸的生成起到重要作用
The cloning of K6 acetate kinase gene fragrnent of Selenomonas r umi na nti um de2 generate primer design with COD EHOP PAN G Xiao2yang1 ,2 , XIN G Xin1 ,L IU Guo2wen1 3 , WAN G Zhe1 ( 1. L aboratory of N ut ri tional an d