miR-296对人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响

·224·
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，恶性肿瘤致死病因中肺癌占27%，位于恶性肿瘤首位［1］。

根据组织病理学特性将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌 （ non -small cell lung cancer，
NSCLC ），其中NSCLC占80%~85%。

相对于其他类型的肺癌，NSCLC增殖、迁移较快，约75%患者发现时已处于中晚期，患者5年生存率较低［2］。

微小RNA是长约22 nt的非编码RNA，它能与目标靶基因特异性结合，通过调控靶基因的表达参与调控细胞分化、增殖、迁移以及凋亡等生理过程，在
糖尿病、心力衰竭以及肿瘤等多种疾病的病理生理发展过程中发挥重要作用。

研究［3-10］表明微小RNA-296 （microRNA -296，miR -296） 与结直肠癌、肝癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、子
· 论著 ·
miR -296对人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响
刘洋1，夏书月1，武晶晶2
（1. 沈阳医学院附属中心医院呼吸与危重症医学科，沈阳 110024；2. 中国医科大学生命科学学院医学遗传学教研室，沈阳 110122） 
摘要 目的 探讨微小RNA-296（miR -296）对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及其潜在的分子机制。

方法 将miR -296表达载体、抑制剂及相应阴性对照分别转染人肺腺癌A549细胞，实时PCR 检测miR -296在不同细胞中的表达情况，CCK8法和平板克隆实验检测miR -296对A549细胞增殖能力的影响，流式细胞术检测细胞凋亡率，Transwell 法检测细胞迁移能力，Western blotting 检测S100A4在各组A549细胞中的表达情况。

结果 与相应的对照组比较，转染了miR -296表达载体的A549细胞miR -296表达显著上调，细胞增殖和迁移能力明显下降，凋亡率明显上升，S100A4蛋白表达下调，差异均有统计学意义 （均P < 0.05） ；而转染了miR -296 抑制剂的A549细胞miR -296表达显著下调，细胞增殖和迁移能力明显增强，凋亡率明显下降，S100A4蛋白表达上调，差异均有统计学意义 （均P < 0.05）。

结论 miR -296通过靶向调控S100A4表达来抑制A549细胞增殖、迁移，促进凋亡。

关键词 微小RNA -296； 肺腺癌细胞； 增殖； 凋亡； 迁移； S100A4
中图分类号 R34 文献标志码 A 文章编号 0258-4646 （2021） 03-0224-06网络出版地址 https:///kcms/detail/21.1227.R.20210317.1350.012.html DOI：10.12007/j.issn.0258‐4646.2021.03.007
Effect of miR -296 on the malignant behavior of lung adenocarcinoma cells LIU Yang 1，XIA Shuyue 1，WU Jingjing 2
（1. Department of Respiratory and Intensive Care Unit，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；2. Department of Medical Genetics，School of Life Sciences，China Medical University，Shenyang 110122，China ） 
Abstract Objective To investigate the effect of microRNA -296（miR -296） on the proliferation，apoptosis，and migration potential of lung adenocarcinoma cells and its underlying molecular mechanisms. Methods miR -296 overexpressing vector，miR -296 inhibitor，and corresponding negative control，were transfected into human lung adenocarcinoma A549 cells. miR -296 expression was assessed by real -time polymerase chain reaction （RT -PCR ） . Cell proliferation was analyzed by the CCK8 cell proliferation assay kit and clone formation. Apoptosis and migration were evaluated by flow cytometry and Transwell assay，respectively，and the expression of S100A4 was assessed by Western blotting. Results Compared with the corresponding negative control group，the proliferative and migratory potential of A549 was dramatically inhibited，the apoptosis rate was significantly elevated，and S100A4 levels were significantly decreased in miR -296 overexpressing cells （all P < 0.05） . In contrast，A549 proliferation and migration were dramatically enhanced，cell apoptosis was significantly decreased，and the expression of S100A4 was significantly increased upon miR -296 inhibition （all P < 0.05） . Conclusion miR -296 inhibits the proliferation and migration，and promotes apoptosis of A549 cells，probably via the regulation of S100A4 expression.Keywords microRNA -296； lung adenocarcinoma cell； proliferation； apoptosis； migration； S100A4
基金项目：辽宁省自然科学基金 （2019-MS -381） ；沈阳医学院科技基
金 （20162028） 
作者简介：刘洋 （1983-），女，副主任医师，硕士.通信作者：刘洋，E -mail：**************************收稿日期：2020-03-17网络出版时间：2021-03-18 13:46
中国医科大学学报 第50卷 第3期 2021年3月
Journal of China Medical University Vol.50 No.3 Mar. 2021
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宫颈癌等肿瘤的发生密切相关，提示miR-296在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用。

然而目前关于miR-296对NSCLC的调控作用尚不清楚。

本研究探讨miR-296在NSCLC增殖、凋亡和迁移等恶性生物学行为中的作用及其潜在的分子机制，旨在为NSCLC的治疗及研究提供新的理论依据及思路。

1材料与方法
1.1 主要试剂及细胞株 
人肺腺癌细胞系 A549细胞 （中科院上海细胞库），DMEM/F12培养基［以色列Biological Industries （BI） 公司］，胎牛血清 （美国Hyclone公司），miR-296抑制剂、阴性对照、引物［生工生物工程 （上海） 股份有限公司］，jetPRIME 转染试剂 （美国 Polyplus Transfection公司），TRIzol （美国Invitrogen公司），反转录试剂盒、universal SYBR qPCR master mix试剂盒、miRNA提取试剂盒、miRNA反转录试剂盒、miRNA universal SYBR qPCR master mix试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒 （中国诺唯赞公司），细胞培养瓶、6孔板、24孔板、96孔板，Transwell小室 （美国Corning 公司），CCK8细胞增殖检测试剂盒 （美国 Abbkine公司）、细胞凋亡试剂盒 （日本东仁公司），结晶紫染液 （北京索莱宝科技有限公司），BCA蛋白浓度检测试剂盒 （中国碧云天公司），S100A4抗体 （美国 Abbkine 公司），Tublin抗体 （中国Proteintech公司）。

1.2 细胞培养、分组及转染 
含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，在37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养A549细胞，倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞密度达80%~90%后，0.5%胰蛋白酶消化，按照1∶2传代培养。

取对数生长期的细胞，2×105/孔接种于细胞培养板中，待细胞生长融合至60%左右时，按照jetPRIME 转染试剂说明书，分别将miR-296表达载体、抑制剂及相应阴性对照转染细胞。

设置空白对照 （Control） 组、miR-296过表达［miR-296 （+） ］组、miR-296过表达阴性对照 ［miR-296 （-） ］组、miR-296 抑制剂 （inhibitor） 组、miR-296抑制剂阴性对照 （inhibitor NC） 组。

1.3 实时荧光定量PCR
TRIzol-氯仿法提取细胞总RNA，茎环法反转录成cDNA，再以cDNA为模板，在Bio-rad CFX Connect 系统中进行实时荧光定量PCR。

引物序列：miR-296反转录引物，GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACACAGGA；miR-296上游引物，5’-GAGGGCCCCCCCTCAA-3’，下游引物，5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；RNU6-1上游引物，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

以RNU6-1为内对照，Bio-rad CFX Manager 3.1软件分析并计算Ct 值。

1.4 CCK8法测定细胞增殖能力 
转染A549细胞24 h后收集细胞，根据分组制成单细胞悬液并在显微镜下计数，按2×103/孔细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养液，培养箱中继续培养 （12、24、48、72、96 h），每孔加10 μL CCK-8溶液，在培养箱中继续孵育1 h，利用多功能酶标仪测定450 nm波长处的吸光度 （optical density，OD） 值，并绘制细胞生长曲线。

1.5 平板克隆形成实验 
细胞转染24 h后，胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以2×103/孔细胞铺于6孔板中，反复吹打并摇匀，使细胞均匀分散，继续培养至每个集落>50个细胞，4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.1%结晶紫染色30 min，在显微镜下计数并分析集落形成数。

1.6 凋亡实验 
细胞转染72 h后胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，2 000 r/min离心5 min收集 （1~5） ×105个细胞，加入500 μL 结合缓冲液悬浮细胞，避光加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀，室温避光反应15 min，转至流式检测管进行流式细胞仪检测。

1.7 Transwell实验 
细胞转染72 h后胰酶消化并用无血清 DMEM/ F12 培养基重悬，计数细胞，将细胞密度调节成 3×104 /mL，取 100 μL 接种到 Transwell （8 μm 孔径） 小室的上室，下室中注入650 μL含10%血清的 DMEM/F12培养基，设置3个复孔，继续培养24 h。

PBS冲洗小室，用棉签将上室中未迁移的细胞蘸去，用 4%多聚甲醛固定已迁移至膜底部的细胞30 min，结晶紫染色30 min，PBS冲洗小室内外，将小室的滤膜用刀片小心切下放在载玻片上，加盖玻片，中性树脂胶封片。

显微镜下计数上、下、左、右和中5个视野的穿膜细胞数，各视野平均穿膜细胞数表示肿瘤细胞的迁移能力。

第3期 刘洋等. miR-296对人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响
·226·1.8 Western blotting检测
细胞转染72 h后RIPA常规提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明测定蛋白浓度。

根据蛋白浓度调整各组样品体积，沸水煮10 min 使蛋白充分变性，取30 μg蛋白SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，100 V电压50 min将凝胶中蛋白转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，S100A4抗体 （1∶1 000稀释）、 Tublin抗体 （1∶2 000稀释） 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，相应二抗 （1∶5 000稀释） 室温孵育1 h，TBST洗膜后，利用超敏ECL化学发光试剂盒、Bio -rad凝胶成像分析仪扫描分析蛋白丰度。

1.9 统计学分析
采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，所有实验
均重复3次，计量资料以x -±s 表示，组间比较采用t 检
验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 miR -296转染A549细胞转染效率的鉴定
结果显示，与miR -296 （-） 组比较，miR -296 （+） 组miR -296表达显著上调 （P < 0.01） ；与inhibitor NC组比较，inhibitor组miR -296表达显著下调 （P < 0.01），见表1，表明转染成功。

2.2 miR -296对A549细胞增殖能力的影响
结果显示，转染48 h后，与Control组和miR -296 
表1 各组A549细胞中miR -296表达、细胞克隆数量、凋亡、迁移能力比较
Tab.1 Comparison of miR -296 expression，number of colonies，apoptosis，and migration in A549 cells Group miR -296 expression Number of colony Apoptosis （%）Migration Control 1.00±0634.3±27.71 - 49.00±5.196miR -296 （-） 1.22±0.253 5599.7±21.87 5.633±0.233 3 49.00±5.132miR -296 （+）34.87±4.918 0 1）393.3±18.28 2） 8.667±0.405 5 2） 19.33±2.028 1）Inhibitor NC 1.85±0.427 8648.3±31.7011.700±0.907 4 48.67±5.364Inhibitor 
0.21±0.074 8 3）
874.7±27.82 3）
6.500±0.635 13）
108.00±7.937 3）
1） P < 0.01， 2） P < 0.05 vs miR -296 （-） group；3） P < 0.05 vs inhibitor NC group.
（-） 组比较，miR -296 （+） 组A549细胞OD值显著降低；与Control组和inhibitor NC组比较，inhibitor组A549细胞OD值则显著升高，差异均有统计学意义 （均P < 0.05），说明miR -296对A549细胞的增殖能力起到抑制作用。

见图1。

2.3 miR -296对A549细胞克隆形成的影响
利用平板克隆技术分析miR -296对A549细胞克隆形成能力的影响，结果显示，与miR -296 （-） 组比较，miR -296 （+） 组A549细胞形成克隆体积更小、数量更少 （P < 0.05），与inhibitor NC组和miR -296 （+） 组比较，inhibitor组A549细胞形成克隆体积更大、数量更多 （P < 0.05，P < 0.01），说明miR -296能抑制A549细胞的克隆形成能力。

见表1、图2。

2.4 miR -296对A549细胞凋亡的影响
流式Annexin -FITC/PI双染法分析miR -296对A549细胞凋亡率的影响，结果显示，与miR -296 （-） 组比较，miR -296 （+） 组A549细胞的凋亡率显著增加 （P < 0.05） ；与inhibitor NC组比较，inhibitor 组A549细胞的凋亡率显著减少 （P < 0.05），说明miR -296促进A549细胞凋亡。

见表1、图3。

2.5 miR -296对A549细胞迁移能力的影响
Transwell细胞迁移实验分析miR -296对A549细胞迁移能力的影响，结果显示，与miR -296 （-） 组比较，miR -296 （+） 组A549细胞迁移能力显著降
*P < 0.05，**P < 0.01 vs miR -296 （-） group or inhibitor NC group. 图1 miR -296对A549细胞增殖能力的影响
Fig.1 Effect of miR -296 on the proliferation of A549 cells
32
1
O D v a l u e a t 450 n m
0 24 48 72 96 120
Time/h Control
miR -296（-）miR -296（+）Inhibitor NC Inhibitor
**
**
****
*
*
中国医科大学学报 第50卷
·227·
低 （P < 0.01） ；与inhibitor NC组和miR -296 （+） 组比较，inhibitor组A549细胞迁移能力显著升高 （均P < 
0.01），说明miR -296对A549细胞的迁移能力起到抑制作用。

见表1、图4。

A，control group；B，miR -296（-） group ；C，miR -296（+） group ；D，inhibitor NC group；E，inhibitor group.
图2 miR -296对A549细胞克隆形成的影响
Fig.2 Effect of miR -296 on clone formation potential of A549 cells.
A，miR -296 （-） group；B，miR -296 （+） group；C，inhibitor NC group；D，inhibitor group.
图3 miR -296对A549细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of miR -296 on A549 cell apoptosis
A，control group；B，miR -296 （-） group；C，miR -296 （+） group；D，inhibitor NC group；E，inhibitor group.
图4 miR -296对A549细胞迁移能力的影响 ×200 
Fig.4 Effect of miR -296 on the migration ability of A549 cells ×200
2.6 miR -296对A549细胞S100A4蛋白表达的影响
结果显示，与miR -296 （-） 组比较，miR -296 （+） 组A549细胞S100A4蛋白表达显著下调 （P < 0.05），与inhibitor NC组和miR -296 （+） 组比较，inhibitor组A549细胞S100A4蛋白表达显著上调 （P < 0.05，P < 0.01），说明miR -296抑制A549细胞S100A4蛋白表达。

见图5。

3 讨论
NSCLC包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。

与
小细胞肺癌比较，NSCLC增殖、迁移相对较快，多数患者发现时已处于中晚期。

因此，明确影响NSCLC增殖、迁移的因素是目前临床急需解决的难题。

近些年随着研究的不断深入，发现越来越多的微小RNA能够参与调控肿瘤细胞分化、增殖、凋亡、侵袭、转移及上皮间质转化 （epithelial -mesenchymal transition，EMT ） 等生物学特性，进而影响肿瘤的发生发展［11］。

miR -296定位于20q13.32，具有高度的保守性，在许多生命活动中发挥着重要的调控作用。

105104103102
105
104103102
105
104103102
105104103102
102 103 104 105FITC -A
102 103 104 105
FITC -A
102 103 104 105
FITC -A
102 103 104 105
FITC -A
Q1Q1Q1Q1Q3
Q3
Q3
Q3
Q2Q2Q2Q2Q4
Q4
Q4
Q4
P I -A
P I -A
P I -A
P I -A
A
B
C D
A B C D E
第3期 刘洋等. miR -296对人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响
A B C D E
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大量证据表明miR -296参与肿瘤的调控作用，而且不同肿瘤中的调控作用亦不同。

VAIRA 等［12］研究发现miR -296在许多肿瘤组织中表达缺失，且与结直肠癌、乳腺癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌等肿瘤的转移密切相关。

VAIRA 等［12］利用人乳腺癌细胞MDA -MB231证明了miR -296发挥着重要的肿瘤抑制作用。

有研究［9］报道抑制miR -296能够通过诱导EMT 促进卵巢癌细胞侵袭，而恢复miR -296表达后肿瘤增殖生长被抑制［12-13］，以上结果均表明miR -296发挥抑制肿瘤的作用。

然而也有研究显示miR -296起到促进肿瘤生长的作用，LEE等［6］发现miR -296-5p 通过SOCS2/STAT3下调NF2受体和Caspase -8促进胶质母细胞瘤侵袭。

本研究结果显示转染miR -296表达载体后，A549细胞增殖、克隆形成及细胞迁移能力显著降低，细胞凋亡率明显上升 （均P < 0.05） ；抑制miR -296后，A549细胞增殖、克隆形成及迁移能力显著升高，凋亡率降低 （均P < 0.05），提示miR -296在A549细胞中发挥肿瘤抑制作用。

S100A4是S100 蛋白家族中的一员，是一种小Ca 2+ 结合蛋白，正常组织中不表达或低表达，而在许多肿瘤 （胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［14-17］） 中高表达，并且在恶性转化、血管生成、迁移和侵袭中发挥调控作用。

有研究［18］表明miR -296通过靶向调控S100A4抑制结直肠癌EMT。

本研究结果发现miR -
296过表达时S100A4蛋白表达下调，而抑制miR -296表达S100A4蛋白表达上调，提示miR -296可能通过靶向调控S100A4表达影响A549细胞的恶性生物学行为。

综上所述，miR -296抑制人肺腺癌A549细胞的增殖、迁移，促进凋亡，其作用机制可能是通过靶向调控S100A4表达来实现的，本研究为NSCLC的临床治疗提供新的靶点和理论基础。

目前，miR -296/ S100A4调控人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的具体机制尚不清楚，仍需进一步研究论证。

参考文献：
［1］ 中华医学会心血管病学分会流行病学组，中国医师协会心血管内科医师分会，中国老年学学会心脑血管病专业委员会. 糖代谢异常与动脉粥样硬化性心血管疾病临床诊断和治疗指南 ［J ］. 中华心血管病杂志，2015，43 （6）：488-506. DOI：10.3760/cma.j.issn.0253-3758.2015.06.008.［2］ CHEN DM，MAO KY，YANG L，et al. Status of anti -lung cancer 
drug patents applications in China from 2003 to 2012 ［J ］. Recent Pat Anticancer Drug Discov，2014，9 （2）：221-240. DOI：10.2174/15748928113086660045.［3］ HE Z，YU L，LUO S，et al. miR -296 inhibits the metastasis and 
epithelial -mesenchymal transition of colorectal cancer by targeting S100A4 ［J ］. BMC Cancer，2017，17 （1）：140. DOI：10.1186/s12885-017-3121-z.［4］ SHI DM，LI LX，BIAN XY，et al. miR -296-5p suppresses EMT of 
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cancer and functions as a potential tumor suppressor ［J ］. Mol Med Rep，2017，16 （1）：466-472. DOI：10.3892/mmr.2017.6602.［9］ YAN W，CHEN J，CHEN Z，et al. Deregulated miR -296/S100A4 
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1，control group；2，miR -296 （-） group；3，miR -296 （+） group；4，inhibitor NC group；5，inhibitor group. *P < 0.05 vs miR -296 （-） group or inhibitor NC group；**P < 0.01 vs miR -296 （+） group.
图5 miR -296对A549细胞中S100A4蛋白表达的影响Fig.5 Eeffect of miR -296 on S100A4 levels in A549 cells.
Control
miR -296（-）miR -296（+）Inhibitor NC Inhibitor
**
*
*
S100A4
Tublin
2.52.01.51.00.50.0
R e l a t i v e S 100A 4 e x p r e s s i o n
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中国医科大学学报 第50卷
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（编辑 武玉欣） 
型，从而提高了诊断肝纤维化程度的灵敏度和特异度，但是该研究仅分析了轻度 （S0~S1） 和显著肝纤维化 （S2~S4） 二者间的差异。

本研究通过有序多因素logsitc分析排除混杂因素，筛选出3个独立预测因素，即PLT、γ-GGT和杨氏模量。

本研究存在一定的局限性，未对建立的模型进行验证，故无法明确其诊断肝纤维化程度的灵敏度和特异度，仍需前沿性试验进一步验证。

综上所述，血清学指标和SWE杨氏模量在评估肝纤维化程度中具有重要临床意义，应用SWE杨氏模量及PLT、γ-GGT构建模型，可预测肝纤维化程度，在临床诊断肝纤维化及其分期、随访中具有重要意义。

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（编辑 陈 姜）
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第3期 刘洋等. miR-296对人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响。