冬小麦ｍｉＲ１７２响应抗寒的特征分析

麦类作物学报　２０２３，４３（１０）：１３０４－１３１０ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｉｔｉｃｅａｅＣｒｏｐ
ｓｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ
．ｉｓｓｎ．１００９ １０４１．２０２３．１０．１１网络出版时间：２０２３ ０８ ２５网络出版地址：ｈｔｔｐ
ｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／６１．１３５９．Ｓ．２０２３０８２４．０９１３．００２冬小麦犿犻犚１７２响应抗寒的特征分析
收稿日期：２０２２ ０７ ３０ 修回日期：２０２２ ０９ ０５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１９７１８３１）第一作者Ｅ ｍａｉｌ：７１４３０５０５６＠ｑｑ．ｃｏｍ通讯作者：苍晶（Ｅ ｍａｉｌ：１９３６９５８６６７＠ｑｑ
．ｃｏｍ）王多佳，王政委，任志鹏，彭瞰看，田宇，张达，徐庆华，苍晶
（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０
）摘　要：东农冬麦１号（Ｄｎ１）是我国首个能在黑龙江省高寒地区安全越冬的强抗寒冬小麦品种。

为了解ｔａｅ ｍｉＲ１７２在Ｄｎ１抗寒中的调控机制，本研究克隆了Ｄｎ１中ｔａｅ ｍｉＲ１７２的前体ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２，根据生物信息学分析预测其靶基因为ＡＰ２ｄｎ１（ＴｒａｅｓＣＳ５Ｄ０２Ｇ４８６６００）。

通过农杆菌介导的烟草瞬时表达试验，进一步证明ｔａｅ ｍｉＲ１７２靶向ＡＰ２ｄｎ１；利用ｑＲＴ ＰＣＲ技术对大田越冬期Ｄｎ１分蘖节中ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和Ａｐ２ｄｎ１的相对表达量进行分析。

结果表明，ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的表达量随温度降低呈先升后降的变化趋势，而靶基因Ａｐ２ｄｎ１的表达量变化趋势则相反，说明ｔａｅ ｍｉＲ１７２负调控Ａｐ
２ｄｎ１的表达。

关键词：冬小麦；ｔａｅ ｍｉＲ１７２；ＡＰ２ｄｎ１；
低温胁迫；表达模式中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３３０ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９ １０４１（２０２３）１０ １３０４ ０７
犃狀犪犾狔狊犻狊狅狀狋犺犲犆犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犿犻犚１７２犚犲狊狆狅狀犱犻狀犵
狋狅犆狅犾犱犚犲狊犻狊狋犪狀犮犲犻狀犠犻狀狋犲狉犠犺犲犪狋
犠犃犖犌犇狌狅犼犻犪，犠犃犖犌犣犺犲狀犵狑犲犻，犚犈犖犣犺犻狆犲狀犵
，犘犈犖犌犓犪狀犽犪狀，犜犐犃犖犢狌，犣犎犃犖犌犇犪，犡犝犙犻狀犵犺狌犪，犆犃犖犌犑犻狀犵
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｔｉｙ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１
５００３０，Ｃｈｉｎａ）犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｄｏｎｇｎｏｎｇｄｏｎｇｍａｉ１（Ｄｎ１）ｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｗｉｎｔｅｒｗｈｅａｔｖａｒｉｅｔｙｉｎＣｈｉｎａｔｈａｔｃａｎｓｕｒｖｉｖｅｔｈｅｗｉｎ ｔｅｒｓａｆｅｌｙｉｎｔｈｅｈｉｇｈａｎｄｃｏｌｄｒｅｇｉｏｎｓｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔａｅ ｍｉＲ１７２ｉｎＤｎ１ｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｔｈｅｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２ｏｆｔａｅ ｍｉＲ１７２ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｉｎＤｎ１ｗａｓｃｌｏｎｅｄ，ａｎｄＡＰ２ｄｎ１（ＴｒａｅｓＣＳ５Ｄ０２Ｇ４８６６００）ｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｓｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅａｃｃｏｒｄｉｎｇｔ
ｏｂｉｏｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙ
ｓｉｓ，ＴｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＡＰ２ｄｎ１ｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｂｙｔａｅ ｍｉＲ１７２ｔｈｒｏｕｇ
ｈＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｏｂａｃｃｏｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．ｑＲＴ ＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２ａｎｄＡＰ２ｄｎ１ｉｎｔｈｅｔｉｌｌｅｒｉｎｇｎｏｄｅｓｏｆＤｎ１ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇｐｅｒｉｏｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２ｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｉｒｓｔａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡｐ２ｄｎ１ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｏｐｐｏｓｉｔｅｔｒｅｎｄ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔａｅ ｍｉＲ１７２ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｐ
２ｄｎ１．犓犲狔
狑狅狉犱狊：Ｗｉｎｔｅｒｗｈｅａｔ；ｔａｅ ｍｉＲ１７２；ＡＰ２ｄｎ１；Ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ 低温是影响小麦生长发育、
分布及产量的重要因素之一。

东农冬麦１号（Ｄｎ１）是我国首个能在黑龙江省高寒地区安全越冬（返青率＞８５％）
的强抗寒性（可耐－３０℃低温）
冬小麦品种［１］，研究其响应低温胁迫的分子机制，对选育耐寒性小麦品种具有重要的理论意义。

ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）
是一类来自真核生物自身基因组的非编码小分子ＲＮＡ，长度一般为２１～
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２５ｎｔ，在转录后调控基因表达，对植物的生长发育、非生物胁迫应答等过程均发挥重要作用［２］。

ｍｉＲＮＡ家族中，ｍｉＲ１７２是最早被发现同时也是被研究最透彻的成员之一［３］，其靶基因主要编码ＡＰ２／ＥＲＦ（ＡＰＥＴＡＬＡ２／ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒ）类转录因子。

ＡＰ２／ＥＲＦ转录因子为植物所特有，几乎参与植物生长发育的各个环节［４］。

研究发现，ｍｉＲ１７２／ＡＰ２模块不仅参与植物生长发育过程（包括花器官发育、块茎、根瘤形成等［５ ７］），也参与植物衰老以及响应逆境等过程［８］。

在小麦中，ｍｉＲ１７２不仅可通过控制驯化基因Ｑ的表达调控穗型发育［９］；也可负调控其靶基因ＡＰ２的表达，参与小麦渗透胁迫响应［１０］。

但有关ｍｉＲ１７２介导作物响应低温胁迫机制的研究鲜有报道。

Ｄｎ１作为强抗寒性冬小麦品种，含有大量与抗寒相关的ｍｉＲＮＡ。

本课题组前期利用构建的不同温度（５℃、－１０℃、－２５℃）下ｍｉＲＮＡ高通量测序数据库，获得了显著差异表达的ｍｉＲ１７２，本研究对其靶基因进行预测，并采用生物信息学、ｑＲＴ ＰＣＲ、瞬时表达等技术分析Ｄｎ１中ｍｉＲ１７２／ＡＰ２模块调控小麦抗寒机制，以期为培育强抗寒性冬小麦品种提供帮助。

１　材料与方法
１．１　试验材料
冬小麦品种为东农冬麦１号（Ｄｎ１），由东北农业大学小麦育种实验室提供。

烟草品种为本氏烟，由东北农业大学植物生理与分子生物学研究室提供。

大肠杆菌ＤＨ５α、农杆菌ＥＨＡ１０５和植物表达载体ＰＢＩ１２１ ＧＵＳ等由本课题组保存。

１．２　大田取样
将Ｄｎ１种子于２０１８年９月８日播种于东北农业大学试验地，种植方法参考田宇等［１１］的报道。

待麦苗长至三叶期，大田自然降温连续１０ｄ平均最低温度为５℃（对照温度，２０１８年１０月１５日）、０℃（２０１８年１１月０２日）、－１０℃（２０１８年１１月２３日）和－２５℃（２０１９年１月１４日）时，选取长势一致的麦苗，剪取分蘖节，置于－８０℃保存，备用。

１．３　犇狀１中狋犪犲 犿犻犚１７２的前体狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２及其靶基因犃狆２的克隆与生物信息学分析１．３．１　ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２及Ａｐ２的克隆
根据本实验室前期建立的Ｄｎ１ｍｉＲＮＡ数据库与已公开的ｍｉＲＮＡ数据库ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）中的小麦ｍｉＲＮＡ数据，获得ｔａｅ ｍｉＲ１７２的前体和成熟体序列。

从小麦基因组数据库ＷｈｅａｔＵＲＧＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｈｅａｔ ｕｒｇｉ．ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ．ｉｎｒａ．ｆｒ／）获取靶基因的ＤＮＡ序列和蛋白序列。

用ＰｒｉｍｅＰｒｉｍｅｒ５．０软件设计克隆ｔａｅ ｍｉＲ１７２的前体ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２及其靶基因Ａｐ２的特异性引物（表１）。

利用ＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＫｉｔ（康为世纪，泰州）提取Ｄｎ１分蘖节总ＤＮＡ，以总ＤＮＡ为模板，以ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２ Ｆ／Ｒ为引物，利用２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｄｙｅ）扩增ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２，ＰＣＲ反应体系为２０μＬ，包括ＤＮＡ模版１μＬ，上、下游引物各１μＬ，２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｄｙｅ）１０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ７μＬ。

ＰＣＲ反应程序：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。

用ＵｌｔｒａｐｕｒｅＲＮＡＫｉｔ试剂盒（康为世纪，泰州）提取Ｄｎ１分蘖节总ＲＮＡ，利用ＨｉＳｃｒｉｐｔＩＩＩ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎ ｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（＋ｇＤＮＡｗｉｐｅｒ）试剂盒（诺唯赞，南京）将ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板，以Ａｄｎ１ Ｆ／Ｒ为引物，利用２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｄｙｅ）扩增靶基因Ａｐ２，ＰＣＲ反应体系同上。

ＰＣＲ反应程序：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。

１．３．２　生物信息学分析
根据ｔａｅ ｍｉＲ１７２的前体和成熟体序列在小麦基因组数据库ＷｈｅａｔＵＲＧＩ获取ｔａｅ ｍｉＲ１７２的染色体位置。

利用ＷｅｂＬＯＧＯ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉ）对ｍｉＲＮＡ成熟体序列进行碱基保守性分析。

利用在线软件ＲＮＡｆｏｌｄＷｅｂＳｅｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）对ｍｉＲＮＡ前体进行茎环结构预测。

利用ｐｓＲＮＡｔａｒｇｅｔ（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔ ｇｒｎ．ｎｏｂｌｅ．ｏｒｇ／ｐｓＲＮＡＴａｒｇｅｔ／ａｎａｌｙｓｉｓ）和ＰＲＮＤ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂｉｏｌｏｇｙ．ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＰＮＲＤ／）对ｔａｅ ｍｉＲ１７２的潜在靶基因进行预测。

利用Ｐｆａｍ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）分析其蛋白结构域。

用ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件预测ＡＰ２蛋白的理化性质。

下载ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ＡＰ２基因ＣＤＳ上游２０００ｂｐ的序列，利用ＰｌａｎｔＣＡＲＥ分析启动子区域的顺式作用元件。

１．４　植物表达载体的构建
在扩增ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ＡＰ２的上、下游引物５’端加上包含酶切位点的１５ｂｐ重组位点序列，分别为５’ ＡＣＧＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ
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５
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第１０期王多佳等：冬小麦ｍｉＲ１７２响应抗寒的特征分析
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３’和５’ ＧＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣ ３’，以此新的引物进行ＰＣＲ扩增，反应体系和反应程序同１．３．１。

将ＰＣＲ扩增产物进行胶回收。

用ＢａｍＨＩ对ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ载体进行单酶切，使用诺唯赞公司的ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ○ＲＵｌｔｒａＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ将ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和Ａｐ２分别连接到酶切后的ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ表达载体上，转入大肠杆菌ＤＨ５α后进行摇菌，然后送哈尔滨博仕生物有限公司进行测序，最终构建ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ｐＢＩ１２１ ＡＰ２载体。

１．５　烟草瞬时表达试验
参考彭瞰看［１２］的方法将构建的表达载体ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ｐＢＩ１２１ ＡＰ２分别转化ＥＨＡ１０５农杆菌。

然后将含有ＰＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２、ｐＢＩ１２１ ＡＰ２的农杆菌菌液以及含有重组质粒ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ｐＢＩ１２１ ＡＰ２的等体积混合农杆菌菌液（ＯＤ
６００
分别为０．５）进行烟草叶片瞬时表达试验，以ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ为对照。

进行烟草叶片注射时，选择生长状态良好且颜色深绿的植株顶端附近２～３片叶。

用注射器（去掉针头）吸取１ｍＬ农杆菌菌液从叶片背部轻轻注射菌液。

每次试验后更换手套以防污染。

注射后，将幼苗在２５℃下孵育５ｄ。

按照Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等［１３］的方法，对三种处理中的ＧＵＳ进行组织化学染色和定量检测。

所有处理均３次重复。

１．６　狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２和犃狆２犱狀１的狇犚犜 犘犆犚分析用ＵｌｔｒａｐｕｒｅＲＮＡＫｉｔ提取冬小麦分蘖节ＲＮＡ，用ｍｉＲＮＡ１ｓｔｓｔａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｉｋｉｔ试剂盒（Ｖａｚｙｍｅ，南京）合成ｃＤＮＡ，用ＣｈａｍＱＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｖａｚｙｍｅ，南京）对ｐｒｅ ｔｔａｅ ｍｉＲ１７２和Ａｐ２进行ｑＲＴ ＰＣＲ，分别以小麦Ｕ６和Ａｃｔｉｎ为内参，以ｑＡＰ２ｄｎ１Ｆ／Ｒ以及ｔａｅ ｍｉＲ１７２ Ｆ和ｍＲＱ３’Ｐｒｉｍｅｒ为引物（表１）。

ＰＣＲ反应体系和反应程序均参照试剂盒说明书，利用２－ΔΔ犆Ｔ法计算ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２及Ａｐ２的相对表达量。

表１　小麦狇犚犜 犘犆犚引物序列
犜犪犫犾犲１　狇犚犜 犘犆犚狆狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳狑犺犲犪狋
引物
Ｐｒｉｍｅｒ引物序列（５’－３’）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５’－３’）
用途
Ｐｕｒｐｏｓｅ
ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２ ＦＴＧＣＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴ
ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７ ＲＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＴＡＧｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的克隆Ｃｌｏｎｅｏｆｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２
Ａｄｎ１ ＦＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＧＡＧＴＴＴＣＡｄｎ１ ＲＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＣＡｐ２ｄｎ１的克隆ＣｌｏｎｅｏｆＡｐ２ｄｎ１
ＴａＡｃｔｉｎ ＦＣＣＴＴＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＴＴａＡｃｔｉｎ ＲＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＧＡ
ＴａＵ６ ＦＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ
ＴａＵ６ ＲＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ
ｑＡＰ２ｄｎ１ ＦＧＣＣＧＧＡＣＡＡＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣ
ｑＡＰ２ｄｎ１ ＲＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡ
ｔａｅ ｍｉＲ１７２ ＦＡＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴ
ｍＲＱ３’Ｐｒｉｍｅｒ由Ｍｉｒ ＸｍｉＲＮＡＦｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ提供
ＳｕｐｐｌｉｅｄｂｙＭｉｒ ＸｍｉＲＮＡＦｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ
ｑＲＴ ＰＣＲ
１．７　数据统计
用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１８进行数据分析，用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｉｍ６．０软件进行ｏｎｅ ｗａｙ或ｔｗｏ ｗａｙ方差分析（ＡＮＯＶＡ）。

２　结果与分析
２．１　狋犪犲 犿犻犚１７２前体狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２的克隆及生物信息学分析结果
对ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２进行克隆并测序，发现ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的长度为３９６ｎｔ（图１Ａ）。

ＵＲＧＩ
数据库分析表明，ｔａｅ ｍｉＲ１７２位于小麦１Ｂ染色体上，其上、下游１０００ｂｐ之间不存在ｍＲＮＡ，属于基因间ｍｉＲＮＡ。

对Ｄｎ１和中国春小麦的ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２序列进行比对，发现Ｄｎ１中该序列缺失２１ｎｔ，推测是由于品种差异性造成的（图１Ｂ）。

用ＷｅｂＬｏｇｏ软件分析ｍｉＲ１７２成熟体序列的保守性，发现ｍｉＲ１７２序列非常保守（图１Ｃ）。

ＲＮＡｆｏｌｄ软件预测发现，ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２形成了一个稳定的二级茎环结构（图１Ｄ），其热力学系综合最小自由能为－１１３．１０ｋｃａｌ·ｍｏｌ－１。

Ｄｎ１中
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６
０
３
１
·麦　类　作　物　学　报 第４３卷
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ｍｉＲ１７２的这些序列特征与拟南芥中ｍｉＲ１７２的
序列特征基本相似，说明ｍｉＲ１７２的功能非常保守。

下载ｔａｅ ｍｉＲ１７２前体序列上游２０００ｂｐ序列，利用ＰｌａｎｔＣＡＲＥ预测启动子区域的顺式作用
元件，结果（表２）表明，ｔａｅ ｍｉＲ１７２启动子区域除含有核心元件外，
还含有响应激素（脱落酸、生长素和赤霉素）和逆境胁迫（干旱）以及与生长代谢（厌氧诱导和响应光）相关的元件。

Ａ：ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的克隆结果；Ｍ：ＤＬ２０００；１：ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｂ：ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２测序结果对比；Ｃ：ｍｉＲ１７２碱基保守性分析；Ｄ：ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的ＲＮＡ二级结构。

Ａ：Ａｍｐｌｉｃｏｎｏｆｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｍ：ＤＬ２０００；１：ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｂ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｃ：Ｍｏｔｉｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｄ：ＲＮＡｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２．图１　狆
狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２的克隆及生物信息学分析结果犉犻犵．１　犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犫犻狅犻狀犳狅狉犿犪狋犻犮狊犪狀犪犾狔
狊犻狊狉犲狊狌犾狋狅犳狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２表２　狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２和犃狆
２犱狀１启动子区域的顺式作用元件犜犪犫犾犲２　犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犮犻狊 犪犮狋犻狀犵犲犾犲犿犲狀狋狊犻狀狆狉狅犿狅狋犲狉狉犲犵犻狅狀狅犳狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２犪狀犱犃狆
２犱狀１元件类别
Ｅｌｅｍｅｎｔｔｙｐ
ｅ元件名称
Ｅｌｅｍｅｎｔｎａｍｅ基因Ｇｅｎｅ
ｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２ＡＰ２ｄｎ１
核心启动子元件ＣｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｅｌｅｍｅｎｔＣＡＡＴ ｂｏｘ＋－核心启动子元件ＣｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｅｌｅｍｅｎｔＴＡＴＡ ｂｏｘ＋＋脱落酸响应元件ＡｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔＡＢＲＥ＋＋茉莉酸响应元件ＪａｓｍｏｎｉｃａｃｉｄｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔＣＧＴＣＡ ｍｏｔｉｆ－＋生长素响应元件ＡｕｘｉｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔＡｕｘＲＲ ｃｏｒｅ＋－赤霉素响应元件ＧｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔＰ ｂｏｘ＋＋厌氧诱导元件ＡｎａｅｒｏｂｉｃｉｎｄｕｃｔｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔＡＲＥ＋＋干旱响应元件ＤｒｏｕｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔＭＢＳ＋＋光响应元件Ｐｈｏｔｏｒｅｓｐ
ｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔＡＴＣ ｍｏｔｉｆ，＋＋Ｂｏｘ４＋＋Ｇ ｂｏｘ＋＋ＭＲＥ＋＋Ｓｐ
１－
＋
＋：
含有；－：不含有。

＋：Ｃｏｎｔａｉｎ；－：Ｎｏｔｃｏｎｔａｉｎ．
２．２　狋犪犲 犿犻犚１７２靶基因的克隆及生物信息学分
析结果
ｐｓＲＮＡｔａｒｇ
ｅｔ和ＰＲＮＤ在线软件预测发现，ｔａｅ ｍｉＲ１７２的靶基因登录号为Ｔ
ＲＩＡＥＣＳ５ＤＯ２Ｇ４８６６００．２。

从小麦基因组数据库ＷｈｅａｔＵＲＧＩ获取靶基因的ＤＮＡ序列并设计引物Ａｄｎ１ Ｆ／Ｒ。

以Ｄｎ１
分蘖节ｃＤＮＡ为模板，克隆靶基因序列，发现其长度为１６５０ｂｐ（图２Ａ），其中ＣＤＳ序列长度为１３５０ｂｐ
（图２Ｂ）。

利用Ｐｆａｍ数据库分析其蛋白结构域，发现其含有两个ＡＰ２结构域（图２Ｃ），将该靶基因命名为ＡＰ２ｄｎｌ。

生物信息学分析表明，ＡＰ２ｄｎｌ蛋白分子量为１１．０８８ｋＤａ
，等电点·
７０３１·第１０期王多佳等：冬小麦ｍｉＲ１７２响应抗寒的特征分析Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
为４．９３。

亚细胞定位预测发现，ＡＰ２ｄｎ１蛋白位于细胞核中。

ＰｌａｎｔｃＡＲＥ软件分析表明，与ｐｒｅ
ｔａｅ ｍｉＲ１７２启动子区域含有的元件相比，ＡＰ２ｄｎ１启动子区域含有茉莉酸响应元件ＣＧＴＣＡ ｍｏｔｉｆ和光响应元件ｓｐ１，而不含有生长素响应元件ＡｕｘＲＲ ｃｏｒｅ和核心启动子元件ＣＡＴＴ ｂｏｘ
（表２）。

２．３　狋犪犲 犿犻犚１７２靶基因犃犘２犱狀１的烟草瞬时表达验证
利用１％的琼脂糖凝胶对ＢａｍＨＩ酶切后的ｐ
ＢＩ１２１ ＧＵＳ载体进行检测，以未酶切的载体为对照（图３Ａ），发现酶切后的载体比未酶切的载体小，证明该载体被线性化。

随后将ｐｒｅ ｔａｅ
ｍｉＲ１７２和Ａｐ２ｄｎ１连接到酶切后的ＰＢＩ１２１ ＧＵＳ载体上，利用１％的琼脂糖凝胶对重组载体
ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１进行菌落ＰＣＲ检测（图３Ｂ和３Ｃ）
，发现均获得了大小正确的条带，表明两个片段已被正确插入。

将测序正确的菌液重新活化，
并提取质粒。

利用农杆菌介导的遗传转化法，在烟草叶片上瞬时表达含有ＧＵＳ基因的ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ、
ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１载体。

发现单独接种含有ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ载体的叶片经组织化学染色后显示为蓝色，有ＧＵＳ表型；单独接种含有ｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１载体的叶片，由于ＡＰ２ｄｎ１与ＧＵＳ基因上游融合，表现出与ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ载体相似的表型；在接种含有ｐＢＩ１２１ ｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２载体的叶片中，ＧＵＳ基因由于被ｔａｅ ｍｉＲ１７２前体剪切，因此染色后的叶片没有观察到ＧＵＳ表型；在ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ｐ
ＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１共转化的叶片中，ＧＵＳ的组织化学染色深度明显降低（图４）。

这说明ｔａｅ ｍｉＲ１７２靶向ＡＰ２ｄｎ１。

Ａ：
ＡＰ２ｄｎ１的克隆结果；Ｂ：ＡＰ２ｄｎ１测序结果比对；Ｃ：ＡＰ２ｄｎ１结构域预测。

Ａ：ＡｍｐｌｉｃｏｎｏｆＡＰ２ｄｎ１；Ｂ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇ
ｎｍｅｎｔｏｆＡＰ２ｄｎ１；Ｃ：ＤｏｍｉｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＡＰ２ｄｎ１．图２　犃犘２犱狀１基因的克隆及生物学分析结果
犉犻犵．２　犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犪狀犪犾狔
狊犻狊狉犲狊狌犾狋狊狅犳犃犘２犱狀１犵犲狀
犲 Ａ：酶切载体电泳图；图Ａ中，Ｍ：ＤＬ１５０００；１：未酶切的ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ载体；２：酶切后的ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ载体。

Ｂ：ｐＢＩ１２１ ｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的菌落ＰＣＲ结果；Ｃ：ｐ
ＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１的菌落ＰＣＲ结果。

图Ｂ和Ｃ中，Ｍ为ＤＬ２０００，１和２为两个重复。

Ａ：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｅｄｖｅｃｔｏｒ；ＩｎｆｉｇｕｒｅＡ，ＭｉｓＤＬ１５０００，１ｉｓｐＢＩ１２１ ＧＵＳｖｅｃｔｏｒｗｉｔｈｏｕｔｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；２ｉｓｐＢＩ１２１ ＧＵＳｖｅｃｔｏｒｗｉｔｈｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｂ：ＣｏｌｏｎｙＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｃ：ＣｏｌｏｎｙＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１．ＩｎｆｉｇｕｒｅｓＢａｎｄＣ，ＭｉｓＤＬ２０００，１ａｎｄ２ａｒｅｔｗｏｒｅｐ
ｌｉｃａｔｅｓ．图３　狆犅犐１２１ 犌犝犛载体构建电泳图犉犻犵
．３　犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犅犐１２１ 犌犝犛狏犲犮狋狅狉·８０３１·麦　类　作　物　学　报 第４３卷
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Ａ：ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ；Ｂ：ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｃ：ｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１；Ｄ：ｐＢＩ１２１ ｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２和ｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１的混合物。

Ａ：ｐＢＩ１２１ ＧＵＳ；Ｂ：ｐＢＩ１２１ ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２；Ｃ：ｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１；Ｄ：ＴｈｅｍｉｘｔｕｒｅｏｆｐＢＩ１２１ ｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２ａｎｄｐＢＩ１２１ ＡＰ２ｄｎ１．图４　通过组织化学染色观察到的犌犝犛表型犉犻犵．４　犌犝犛狆犺犲狀狅狋狔狆犲狅犫狊犲狉狏犲犱犫狔犺犻狊狋狅犮犺犲犿犻犮犪犾狊狋犪犻狀犻狀犵
２．４　低温胁迫下犇狀１中狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２和犃犘２犱狀１的表达模式利用ｑＲＴ ＰＣＲ技术分析ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２及ＡＰ２ｄｎ１在５℃、０℃、－１０℃和－２５℃四个温度下的表达模式。

结果表明，ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的表达量随着温度的降低呈先升后降的变化趋势，０℃时表达量最高，－２５℃时表达量最低（图５Ａ）。

ＡＰ２ｄｎ１的表达量变化趋势与ｐｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２相反，
随着温度的降低呈先降后升的变化趋势，在－２５℃表达量最高，０℃表达量最低（图５Ｂ）。

推测ｔａｅ ｍｉＲ１７２负调控ＡＰ２ｄｎ１的表达。

３　讨论
ｍｉＲ１７２是一个非常保守的ｍｉＲＮＡ，
参与植物不同生长发育过程。

在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆
狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）
中，ｍｉＲ１７２与ｍｉＲ１５６相互作用，通过调控拟南芥中ＳＰＢ和ＡＰ２基因的表达来控制发育
时间［１４ １５］。

在大岩桐（犛犻狀狀犻狀犵犻犪狊狆
犲犮犻狅狊犪）中，ｍｉＲ１７２通过调控ＡＰ２基因的表达来影响花器官
的发育［１６
］。

另外，ｍｉＲ１７２在植物抗逆过程中也具有重要作用，如拟南芥ｍｉＲ１７２参与对干旱胁迫的响应；大豆（犌犾狔
犮犻狀犲犿犪狓）ｍｉＲ１７２调控根系对盐胁迫的敏感性［１７］；香蕉（犕狌狊犪狀犪狀犪）ｍｉＲ１７２
参与对寒冷胁迫的响应［１８］。

迄今为止，小麦
ｍｉＲ１７２响应低温胁迫的研究尚未见报道。

在本
研究中，ｔａｅ ｍｉＲ１７２前体ｐ
ｒｅ ｔａｅ ｍｉＲ１７２的表达量随着温度的降低呈先升后降的趋势，在０℃时达到峰值，随后逐渐下降，到－２５℃时最低，说明Ｄｎ１中ｔａｅ ｍｉＲ１７２对低温胁迫的响应非常灵敏，推测在Ｄｎ１抗寒过程中起调节作用。

、 和 分别表示与对照温度（
５℃）间在０．０５、０．０１和０．００１水平上差异显著。

， ａｎｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（５℃）ａｔ０．０５，０．０１ａｎｄ０．００１ｌｅｖｅｌｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
．图５　低温胁迫下犇狀１分蘖节中狆
狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２（犃）和犃犘２犱狀１（犅）的表达模式犉犻犵．５　犈狓狆
狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳狆狉犲 狋犪犲 犿犻犚１７２（犃）犪狀犱犃犘２犱狀１（犅）犻狀狋犻犾犾犲狉狀狅犱犲狊狅犳犇狀１狌狀犱犲狉犮狅犾犱狊狋狉犲狊狊 本研究通过生物信息学预测到ｔ
ａｅ ｍｉＲ１７２的靶基因为ＡＰ２家族基因ＡＰ２ｄｎ１，通过烟草瞬时表达试验，说明ｔａｅ ｍｉＲ１７２负向调控ＡＰ２ｄｎ１
基因的表达，这与Ｊｕｎｇ等［５］和梅林等［１９］的研究
结果一致。

利用ｑＲＴ ＰＣＲ技术分析ＡＰ２ｄｎ１在
不同温度下的表达模式，发现ＡＰ２ｄｎ１与冬小麦抗寒有关，并起正向调控作用。

由于Ｄｎ１中
ＡＰ２ｄｎ１响应低温胁迫的过程也可能受细胞内激
素、
光照、温度、水分等因素的调控，具体调控机制有待进一步探究。

·
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根据低温胁迫程度的不同，低温胁迫可以划分为冷害（０～２０℃）和冻害（＜０℃）。

两种低温胁迫都会改变植物的细胞结构、生理代谢以及蛋白活性等，从而影响植物的生长发育［２０］。

植物在应对冷害胁迫和冻害胁迫时存在不同的调控模式，本研究Ｄｎ１中ｍｉＲ１７２／ＡＰ２的调控模式在两种低温胁迫下存在差异，推测抗寒小麦品种Ｄｎ１中ｍｉＲ１７２／ＡＰ２模块响应冷害和冻害的机制不同，需要进一步验证。

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［２０］ＬＩＵＺ，ＪＩＡＹ，ＤＩＮＧＹ，犲狋犪犾．ＰｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅＣＲＰＫ１ ｍｅｄｉａｔｅｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆ１４ ３ ３ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｄｕｃｅｓｔｈｅｉｒｎｕｃｌｅａｒｉｍｐｏｒｔｔｏｆｉｎｅ ｔｕｎｅ犆犅犉ｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇｃｏｌｄｒｅ ｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．犕狅犾犲犮狌犾犲狉犆犲犾犾，２０１７，６６（１）：１１７．
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·麦　类　作　物　学　报 第４３卷
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