麝香保心丸通过调控miR-144-3p

麝香保心丸通过调控miR -144-3p/SLC7A11减轻
心肌缺血再灌注损伤的实验研究
叶 健,汪 谞,席 鑫,郜俊清,刘宗军,李凌燕
摘要 目的:探讨麝香保心丸干预心肌缺血再灌注(I/R )损伤大鼠的作用机制㊂方法:将20只SD 大鼠采用随机数字表法分为control 组㊁I/R 组㊁I/R +麝香保心丸组㊁I/R +铁抑素-1(Fer -1)组,每组5只㊂对照组及I/R 组给予生理盐水2mL/d 灌胃,I/R +麝香保心丸组给予麝香保心丸150mg/(kg ㊃d )灌胃,I/R +Fer -1组大鼠腹腔注射1mg/(kg ㊃d )Fer -1,5d 后制备心肌缺血再灌注模型,control 组仅开胸后缝合㊂再灌注24h 后检测大鼠心功能以及外周血肌酸激酶同工酶(CK -MB )㊁乳酸脱氢酶(LDH )㊁肌钙蛋白T 水平;苏木精-伊红(HE )染色观察大鼠心肌的病理情况㊂结果:麝香保心丸及Fer -1均可改善模型大鼠心功能,降低外周血CK -MB ㊁LDH ㊁肌钙蛋白T 水平(P <0.05),下调心肌miR -144-3p ,提高SLC7A11蛋白及谷胱甘肽(GSH )㊁氧化型谷胱甘肽(GSSG )表达水平(P <0.05)㊂HE 染色提示Fer -1或麝香保心丸预干预可以减轻I/R 心肌细胞排列混乱,缩小细胞组织间隙㊂结论:麝香保心丸可以减轻心肌缺血再灌注损伤,其机制可能与miR -144-3p/SLC7A11信号通路,减轻心肌细胞铁死亡有关㊂关键词 缺血再灌注损伤;麝香保心丸;铁死亡;心功能;谷胱甘肽;实验研究
d o i :10.12102/j
.i s s n .1672-1349.2023.13.010 急性心肌梗死(
acute myocardial infarction ,AMI )是严重威胁人类健康的疾病,具有高致残率㊁致死率,
发病率仍逐年上升[
1]
㊂迅速开通堵塞血管是降低死亡率㊁改善预后的重要手段,但无论是介入还是溶栓治疗都无法避免再灌注损伤㊂缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury ,I/R )是由于血流恢复后损伤进一步加重的情况,具体机制尚不明确,其中包含了以坏死和细胞程序性死亡为主的多种细胞损伤和死亡模式[
2]
㊂在缩短血管开通时间的前提下,减轻I/R 是改善病人预后的重要手段㊂铁死亡是一种以铁沉积和脂质过氧化物为特征,有别于凋亡㊁坏死的细胞程序性死亡方
式[3]
㊂研究发现,铁死亡在心肌I/R 中起重要作用,抑制铁死亡能减轻再灌注心肌损伤[
4]
㊂麝香保心丸是治疗冠心病的常用药物,来源于宋
代‘太平惠民和剂局方“所记载的苏合香丸㊂现代研究发现,麝香保心丸具有心肌重构㊁改善血管内皮功能㊁促进血管新生㊁缩小斑块及改善心肌I/R 等多重作
用[5-7],课题组前期研究发现,麝香保心丸可以通过调控
miR -144-3p/SLC7A11信号通路减轻心肌细胞铁死亡[8]
,但其减轻心肌I/R 是否与该信号通路有关不得而知,本研究旨在明确麝香保心丸改善心肌I/R 是否与调控
基金项目 上海市医学重点专科项目(No.ZK2019A11);上海市普陀区优势学科项目(No.2019ysxk01);上海市中医药传承和科技创新项目(No.ZYCC2019026);中华中医药学会青年人才托举工程项目(No.QNRC2-B03);上海市普陀区卫生健康系统科技创新项目(No.ptkwws202209);上海中医药大学预算内项目(No.2021LK054)作者单位 上海中医药大学附属普陀医院(上海200062)通讯作者 李凌燕,E -mail :**************引用信息 叶健,汪谞,席鑫,等.麝香保心丸通过调控miR -144-3p/SLC7A11减轻心肌缺血再灌注损伤的实验研究[J ].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(13):2396-
2399.miR -144-3p/SLC7A11信号通路抑制铁死亡有关㊂1 材料与方法
1.1 实验材料㊁试剂及动物
20只SD 大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(序号:0043893),所有动物遵循动物实验伦理,给予充足的食物㊁饮水,饲养在温度18~26ħ㊁相对湿度
40%~70%的环境中㊂麝香保心丸(上海和黄药业)用无菌生理盐水制成混悬液,SLC7A11抗体购自Abcam ,铁抑素-1(Fer -1)购自Sigma ,酶联免疫吸附试验(ELISA )试剂盒㊁二喹啉甲酸(BCA )蛋白定量试剂盒及发光试剂盒购自碧云天生物技术公司,苏木精-伊红(HE )染色试剂盒由上海莱哲生物科技有限公司提供㊂
1.2 I/R 模型构建及分组
3%的戊巴比妥钠1.5mL/kg 腹腔注射,颈部及胸腔毛发剪除消毒,颈部中间开口1cm ,胸骨舌骨肌止血钳钝性分离暴露气管,显微剪刀切开小口,开口不宜过大,插入呼吸机插管,呼吸机参数:呼吸频率90次/min ,呼吸比为1ʒ2,生理盐水棉球盖住创口㊂于第3肋与第4肋骨间(可手按胸腔感知心脏跳动最明显位置)皮肤开口1cm ,下行处有一条小静脉可两端止血钳夹住10s ,用剪刀剪断,肋间开小口0.5cm ㊂两个撑开器上下左右以肋骨配合撑开,暴露心脏,止血钳挑开心包膜,再夹住胸腺部位固定,另一只手持针(5-0缝合线)左心耳下方3mm 处进针,深度1mm ,宽度2mm 扎针进线后在上方放一根直径0.53mm ㊁长5cm 鱼线,
活结结扎㊂缝合闭胸,2h 后轻抽鱼线再灌注㊂术后每只大鼠给予8ˑ105U 青霉素0.5mL 抗炎㊂再灌注24h 后进行后续实验㊂
采用随机数字表法分为control 组㊁I/R 组㊁I/R +麝香保心丸组㊁I/R +Fer -1组,每组5只㊂control 组及I/R 组给予生理盐水2mL/d 灌胃,I/R +麝香保心丸组给予麝香保心丸150mg/(kg ㊃d )灌胃,I/R +Fer -1组大鼠
腹腔注射1mg/(kg㊃d)Fer-1,5d后制备心肌I/R模型,control组仅开胸后缝合㊂
1.3心功能检测
采用PHILIPS CX50超声系统检测左心室射血分数(LVEF)㊁左室舒张末期内径(LVEDD)㊁左室短轴缩短率(FS)㊂3%戊巴比妥麻醉后,将大鼠备皮并固定在手术台上,将线阵探头放在胸骨左侧,采集最佳的二维图像,清晰显示心尖及左右房室腔切面㊁左心室长轴,以看到M型曲线为准㊂检测心功能相关指标,并计算LVEF,取连续心动周期的平均值作为最后结果进行统计学分析㊂
1.4心肌组织处理
取出心脏组织标本,清洗后,一部分用4%的多聚甲醛溶液固定,包埋在石蜡中,采用HE染色观察心肌病理情况;留取部分心肌组织-80ħ冻存㊂
1.5血清学指标
3%戊巴比妥麻醉后,5mL注射器腹主动脉取血, 2000r/min离心10min,参考说明书,用ELISA试剂盒检测大鼠外周血肌酸激酶同工酶(CK-MB)㊁乳酸脱氢酶(LDH)㊁肌钙蛋白T浓度㊂
1.6实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组miR-144-3p表达水平
取出-80ħ中剩余心肌组织,Trizol法提取总RNA,逆转录为cDNA,参照说明书进行RT-PCR反应㊂miR-144-3p引物序列:正向引物为5'-GCAGAG T ACAG-T A T AGA TGA TG-3';反向引物为5'-GTGCAGGG TC-CGAGGT-3'㊂
1.7蛋白水平检测
提取-80ħ冻存心肌组织蛋白,BCA法检测蛋白浓度,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌梗死区SLC7A11,用Promega GSH/GSSG-GloTM Assay试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)㊁氧化型谷胱甘肽(GSSG)表达水平㊂1.8统计学处理
采用SPSS22.0统计软件对数据进行统计学处理㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,方差分析用于比较正态分布组之间的测量数据;如果两组之间的方差是均匀的,LSD检验被用作事后检验,否则使用Games Howell测试㊂非正态分布数据采用Kruskal-Wallis检验;当两组之间存在差异时,使用Mann-Whitney U检验,均采用双侧检验㊂以P< 0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1梗死区心肌中miR-144-3p表达情况
RT-PCR实验结果提示,与control组比较,I/R组梗死区心肌miR-144-3p表达明显升高,I/R+麝香保心丸组经麝香保心丸预处理后miR-144-3p表达较I/R 组下降,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见图1㊂
图13组梗死区心肌中miR-144-3p表达
(与control组比较,*P<0.05;
与I/R组比较,#P<0.05)
2.2心肌组织SLC7A11蛋白表达情况
Western Blot实验显示,与control组比较,I/R组SLC7A11蛋白表达下降,I/R+麝香保心丸组经麝香保心丸预处理后SLC7A11蛋白表达较I/R组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见图2㊂
图23组SLC7A11蛋白表达比较
(A为3组SLC7A11蛋白表达电泳图;B为3组SLC7A11蛋白表达柱状图㊂与control组比较,*P<0.05;与I/R组比较,#P<0.05)
2.3心肌GSH㊁GSSG表达情况
与control组比较,I/R组GSH㊁GSSG表达明显下降,I/R+麝香保心丸组经麝香保心丸预处理后GSH㊁GSSG表达水平较I/R组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见图3㊂
2.4外周血CK-MB㊁LDH㊁肌钙蛋白T浓度比较
与control组比较,I/R组CK-MB㊁LDH㊁肌钙蛋白T水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与I/R组比较,I/R+麝香保心丸组㊁I/R+Fer-1组CK-MB㊁LDH㊁肌钙蛋白T水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见表1㊂图33组GSH/GSSH表达水平比较(与control组比较,*P<0.05;
与I/R组比较,#P<0.05)
表14组外周血CK-MB㊁LDH㊁肌钙蛋白T浓度比较(xʃs)
组别只数CK-MB(U/L)LDH(U/L)肌钙蛋白T(ng/L) control组595.20ʃ12.83184.80ʃ16.50 1.74ʃ0.25 I/R组5852.00ʃ44.43①1604.00ʃ89.11①16.08ʃ1.14①I/R+麝香保心丸组5198.00ʃ23.14②658.60ʃ77.31② 2.37ʃ0.41②I/R+Fer-1组5281.80ʃ26.96②1081.40ʃ64.77② 3.19ʃ0.60②注:与control组比较,①P<0.05;与I/R组比较,②P<0.05㊂
2.5心功能指标比较
与control组比较,I/R组大鼠LVEF㊁FS明显降低,LVEDD明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与I/R组比较,I/R+麝香保心丸组㊁I/R+Fer-1组LVEF㊁FS明显升高,LVEDD明显缩小,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见表2㊂
表24组大鼠心功能指标比较(xʃs)
组别只数LVEF(%)FS(%)LVEDD(mm) control组593.18ʃ2.4463.68ʃ6.17 5.35ʃ0.71 I/R组536.78ʃ4.76①18.49ʃ2.34①8.61ʃ2.12①I/R+麝香保心丸组553.06ʃ13.60②28.69ʃ9.08② 6.69ʃ0.94②I/R+Fer-1组549.62ʃ8.99②26.38ʃ5.76②7.95ʃ1.56②注:与control组比较,①P<0.05;与I/R组比较,②P<0.05㊂
2.6HE染色
control组大鼠梗死区HE染色未见明显损伤,心肌细胞排列整齐,I/R组大鼠细胞排列混乱并可见组织间隙变大,I/R+麝香保心丸组㊁I/R+Fer-1组大鼠心脏组织病理学改变均有不同程度的改善㊂详见图4㊂
图44组大鼠梗死区心肌HE染色图
3讨论
I/R是急性心肌梗死治疗过程中无法避免的问题,有研究显示,由于再灌注损伤导致的心肌损伤面积可达心肌梗死的最终心肌损伤面积的50%[9]㊂I/R机制目前尚未明确,但普遍认为与再灌注过程中Ca2+积聚㊁脂质氧化及心肌中增加的活性氧(ROS)密切相关[10-11]㊂近年来研究发现,铁死亡在缺血再灌注过程中发挥重要作用[12-13],铁螯合剂的运用可以明显减少心肌I/R损伤[4]㊂Fer-1是一种芳烷基胺类化合物,可以通过与Fe2+结合形成铁素-铁络合物降低细胞内
Fe2+,减少脂质被Fe2+氧化,抑制铁死亡[14]㊂在本研究中,I/R组大鼠心功能较control组明显降低,外周血心肌损伤指标明显升高,Fer-1及麝香保心丸预处理后I/R大鼠心功能得到恢复,外周血心肌损伤指标明显下降,心肌病理损伤减轻,说明铁死亡存在于心肌缺血再灌注过程中,且可以通过药物干预,前期研究也得到了类似的结果[13],同时提示麝香保心丸可以减轻心肌I/R,改善心功能㊂miR-144-3p是一种与细胞凋亡密切相关的非编码RNA,可以抑制多种细胞的增殖㊁迁移能力,且与氧化应激密切相关[15-18]㊂课题组前期研究发现,麝香保心丸可以调控心肌细胞铁死亡,且机制与降低miR-144-3p表达水平㊁上调SLC7A11蛋白相关[8]㊂SLC7A11编码胱氨酸/谷氨酸交换转运体系统XC-(xCT),抑制SLC7A11(xCT)能减少细胞外胱氨酸进入细胞质,并减少GSH的合成,增加氧化应激㊂已有研究证实,SLC7A11是铁死亡的关键信号分子[19-20]㊂在本研究中,麝香保心丸可降低I/R心肌中miR-144-3p 表达水平,并上调SLC7A11及GSH㊁GSSG表达量,与课题组前期细胞实验结果相类似;GSH㊁GSSG能够减轻I/R损伤中的氧化应激[21],提示麝香保心丸可能是通过调控miR-144-3p/SLC7A11信号通路减轻心肌I/R损伤中的氧化应激㊂
综上所述,麝香保心丸能改善心肌I/R,其机制可能与调控miR-144-3p/SLC7A11信号通路,上调GSH㊁GSSG 表达水平,抑制心肌细胞铁死亡,减轻氧化应激相关㊂
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(收稿日期:2022-12-02)
(本文编辑郭怀印)。