抗pgp 基因工程抗体sc fv 的构建达及其活性测定表

·免疫学技术与方法·
抗Pgp基因工程抗体ScFv的构建、表达及其活性测定①
高瀛岱　熊冬生　彭　晖　许元富　邵晓枫　范冬梅　杨纯正
(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室,天津300020)
中国图书分类号　R392112 文献标识码　A 文章编号　10002484X(2004)0420267205
[摘　要]　目的:构建表达抗PgpScFv,进行体外活性的测定。

方法:利用RT2PCR方法,克隆抗Pgp杂交瘤细胞PH M AO2的重链可变区基因(VH),轻链可变区基因(V L),拼接为单链抗体(ScFv),再克隆到具有强启动子的PET28a(+)载体上进行表达,并进行了表达产物体外活性的测定。

结果:构建了表达质粒PET28a(+)2ScFvPG P。

表达产物可与表达Pgp抗原的K562ΠA02细胞特异性结合,并不抑制Pgp外排泵的功能。

结论:构建表达的抗PgpScFv只有针对Pgp抗原的识别功能,并无抑制作用,因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能,无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂,均具有广泛的应用前景。

[关键词]　单克隆抗体;ScFv;P糖蛋白
Expression and characterization of recombinant ScFv antibody detecting p2glycopro2 tein
G AO Ying2Dai,XIONG Dong2Sheng,PENG Hui,XU Yuan2Fu,SH AO Xiao2Feng,F AN Dong2Mei,Y ANG Chun2Zheng. State K ey Laboratory o f Experiment H ematology,Institute o f H ematology,C AMS and PUMC,Tianjin300020,China
[Abstract]　Objective:Expression and characterization of recombinant ScFv antibody detecting P2glycoprotein.Methods:Amplify the gene of variable region of heavy chain(VH)and light chain(V L)of the antibody against P2glycoprotein from hybridoma cell line PH M A02. VH and V L genes were joined as single chain Fv(ScFv)by a flexible peptide linker and cloned into the plasmid PET28a(+)to construct the ScFv expression vector PET28a(+)2PgpScFv,and expressed from E.coli.R esults:The anti2Pgp ScFv was expressed,is olated and purified. Like the native Mab PH M A02,the recombinant ScFv showed specific binding activity for the resistant cell line K562ΠA02,but can not block the activity of Pgp.
[K ey w ords]　M onoclonal antibody;ScFv;P2glycoprotein
恶性肿瘤是我国重点攻关疾病之一,而肿瘤细胞对抗癌药物的耐受是导致临床化疗失败的主要原因。

肿瘤细胞对一系列结构及作用机制不同的药物产生交叉耐药的现象称为多药耐药(Multidrug Resis2 tance,M DR)。

产生M DR最主要的分子基础是细胞膜表面分子量为170kD的糖蛋白P2glycoprotein (Pgp)。

Pgp是ATP依赖性的药物外排泵,可将各种不同的细胞毒药物泵出到细胞外,从而降低细胞内的药物浓度,阻止药物杀伤细胞的作用1。

通过对Pgp蛋白的深入研究发现,Pgp不仅与耐药相关,还与肿瘤的侵袭、转移等生物学特性相关2。

国内外相关资料表明,消化系统肿瘤、乳腺癌等恶性肿瘤细
①国家自然基金资助项目(批准号39900186)Supported by the National
Sciences F oundation of China(39900186)
作者简介:高瀛岱(1975年-),女,分子药理学博士;
通讯作者与指导教师:杨纯正(1938年-),男,教授,博士生导师,主
要从事药理学及分子生物学研究。

胞的Pgp及其mdr21基因mRNA的水平与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。

国外发现肺癌、结肠癌转移淋巴结有Pgp阳性高表达,我们初步实验也证实,乳腺癌转移灶亦有Pgp高表达。

在白血病、淋巴瘤、神经母细胞瘤,Pgp的高表达与疗效差是高度相关的。

由此可见Pgp既可作为肿瘤恶性进展的诊断学标志,也可作为新型的治疗靶点,而且在多种耐药的实体瘤及白血病细胞系均有Pgp的高表达,所以针对Pgp这一广谱肿瘤抗原的治疗具有广泛的应用前景3,4。

抗Pgp(P2glycoprotein)的单克隆抗体在肿瘤的诊断、治疗中具有广泛的应用前景。

为避免鼠源性单抗应用于人体后所产生的人抗小鼠抗体(Hu2 man Anti2m ouse Antibody,H AM A)反应,本文在我室自行制备的抗Pgp杂交瘤细胞PH M AO2的基础上,利用噬菌体抗体库技术构建了抗PgpScFv的抗体库并进行了筛选。

鉴于筛选到的克隆进行分泌性表达后产量较低,将筛选到的高活性克隆基因克隆到具
有强启动子的PET28a(+)载体上进行表达,表达产物为包涵体,经复性后得到具有活性的抗PgpScFv,并进行了体外活性的测定。

1　材料与方法
111　材料
11111　细胞株和质粒　载体PC ANT AB5E购自Pharmacia,载体PET28a(+)购自Novagen。

大肠杆菌菌株TG1,BL21由本室保存。

阿霉素诱导的多药耐药细胞株K562ΠA02由本室建立5。

11112　试剂　限制性内切酶购自GI BC OBR L公司。

鼠抗Pgp单克隆抗体PH M A02(MabPH M A02)由本室制备6。

PCR引物为上海生工生物工程公司合成。

IPTG购自Sigma公司。

鼠抗E2tag2HRP、鼠抗E2tag 单抗购自Pharmacia公司。

PCR扩增仪(PE2400,PE 公司),离心机,Chelating Sepharose Fast Flow(Pharma2 cia公司)。

112　抗Pgp单克隆抗体轻、重链基因的克隆、拼接及单链抗体表达载体的构建　从状态良好的杂交瘤细胞PH M A02中提取总RNA,以olig o(dT)15(Pro2 mega)为随机引物,逆转录生成cDNA。

然后采用通用的兼并性引物特异性分别扩增抗体轻、重链可变区基因。

将抗体轻、重链可变区基因用一编码(G4S)短肽的DNA片段连接成5’VH2Linker2V L3’片段,PCR扩增该片段,并在5’端加上NheⅠ酶切位点,在3’端加上HindⅢ酶切位点。

5’端引物:5’C AT ATGG CT AG CC AGG TC AAACTG C AG C AG TC3’,3’端引物:5’G CG T ACCT AAG CTTCCG TTTT ATTTCC AG C TT2GG T3’。

纯化后的ScFv片段经酶切后与经Nhe Ⅰ+HindⅢ处理后的PET28a(+)载体(已预先装入Etag短肽)作为蛋白鉴定标记,连接(16℃,过夜),构建的PET28a(+)2PgpScFv质粒。

113　序列分析　应用荧光引物标记的双脱氧末段终止法进行序列分析。

114　抗PgpScFv抗体片段表达和纯化　用构建的PET28a(+)2PG P质粒转化大肠杆菌BL21,并在含有50μgΠml卡那霉素,LB平板(1%agar)上筛选转化子。

挑取经鉴定正确的单克隆活化后,37℃振荡培养至OD600=017～019,加入IPTG(终浓度为100μm olΠL),37℃,250rΠmin诱导表达3小时,6200g, 4℃离心15分钟收集菌体。

收集的菌体沉淀用冰预冷的50mm olΠL Tris2 HCl、100mm olΠL NaCl、1mm olΠL E DT A、pH710溶解。

超声破碎细胞,30000g离心30分钟(4℃)。

沉淀在3m olΠL尿素和50mm olΠL Tris2HCl pH710溶解,离心30000g30分钟(4℃)收集包涵体,6m olΠL盐酸胍和011m olΠL Tris2HCl pH710于4℃摇动过夜溶解包涵体。

4℃30000g离心30分钟去除沉淀,上清用于纯化。

用镍离子螯合柱纯化包涵体中的目的蛋白,再用TE A缓冲液(014m olΠL精氨酸2HCl,011m olΠL Tris2HCl,2mm olΠL E DT A,pH710)透析复性。

115　S DS2PAGE电泳及Werstern blot分析　样品经12%S DS2PAGE,考马斯亮蓝R250染色。

同样的S DS2PAGE凝胶转移到醋酸纤维素膜上,用于West2 ern杂交。

基于表达产物末段的E2tag短肽,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗E2tag抗体为一抗,与底物二氨基联苯胺反应后显色。

116　免疫荧光竞争实验　将K562ΠA02制成5×105细胞悬液,加样于40孔细胞培养板,2×106Π孔,单抗PH M A02715μlΠ孔(418μgΠμl),阴性对照组加无关抗体(抗C D3抗体HIT3a)15μl(3μgΠμl),4℃孵育1小时。

P BS洗2次,加纯化后抗PgpScFv50μgΠ孔,4℃孵育1小时。

P BS洗2次,加兔抗鼠荧光抗体,4℃孵育40分钟。

P BS洗去未结合的荧光抗体,流式细胞仪测定。

117　抗体亲和力的测定　用125I标记抗体(氯胺T 法),等倍稀释的标记抗体与K562ΠA02细胞4℃孵育2小时,P BS洗涤,然后2000rΠmin离心10分钟,弃上清,重复4次,置于γ计数仪上测定CPM值。

同时,以加入20倍过量的抗Pgp单抗PH M A02作为对照组,以去除非特异性吸附。

118　流式细胞仪测定细胞内Rh123的蓄积7　取对数生长期的K562和K562ΠA02细胞,用冷生理盐水洗2次,以无血清RPMI1640稀释成细胞浓度为5×105ml-1,加入113μm olΠL的荧光染料Rh123,再分别加入:λ.1μm olΠL单抗PH M A02,µ.4μm olΠL 抗PgpScFv。

以10μm olΠL VRP(维拉帕咪)作为阳性对照,以不含Rh123的细胞悬液作为阴性对照。

与细胞共同孵育60分钟后冷生理盐水洗去Rh123,继续孵育2小时,冷生理盐水洗2次,流式细胞仪(激发波长488nm,发射波长530nm)检测细胞内Rh123的浓度。

2　结果
211　抗Pgp单克隆抗体轻、重链基因的克隆、拼接及单链抗体表达载体的构建　从PH M A02杂交瘤细胞提取的mRNA,经RT2PCR技术扩增后在琼脂糖电泳凝胶上检出300bp左右的VH基因和300bp左右的V L基因,用一短肽(G4S)3将VH和V L基因连接
图1　抗PgpScFv的测序结果
Fig.1　DNA sequence of anti2PgpScFv polylinker is show ed in low er
case
图2　抗PgpScFv蛋白的SDS2PAG E分析和W estern b lot结果Fig.2　SDS2PAGE and Western blot analysis of anti2PgpScFv N ote:Mr:Low rang weight marker;1.anti2PgpScFv eluted from the Ni column analyzed by12%S DS2PAGE;2.anti2PgpScFv eluted from the Ni col2 umn analyzed by immunoblot.起来,并在PCR的过程中在基因片段的两侧加上NheⅠ(5’端)和HindⅢ(3’端)酶切位点,再用这两种酶消化该片段,而后与被同样消化的载体连接,从而构建含抗PgpScFv抗体基因片段的表达载体PET28a (+)2PgpScFv,PCR、酶切鉴定证明插入正确。

212　序列分析　测序结果(图1)表明该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点,该序列为抗体基因序列。

213　抗PgpScFv抗体片段表达和纯化含有质粒PET28a(+)2PgpScFv的BL21工程菌经IPTG诱导,表达产物为包涵体形式。

经透析复性后,可得到约800μgΠL的目的蛋白,S DS2PAGE凝胶上显示出分子量约为30kD的表达带,Western印记结果证明条带为表达产物(图2)。

214　免疫荧光竞争实验　Mab PH M A02与Pgp
表达
图3　竞争性免疫荧光抑制实验
Fig.3　Competitive inhibition of immune fluorrescence experiment
N ote:1.HIT3a(anti CD3M cAb);2.PH M A02+P BS;3.PH M A02+ScFv.
阳性细胞K 562ΠA02的结合阳性率为96144%,经抗PgpScFv 竞争后,PH M A02与K 562ΠA02的结合阳性率为51108%。

实验证明,抗PgpScFv 能与小鼠抗Pgp 全抗竞争结合表达Pgp 抗原的K 562ΠA02细胞,即抗PgpScFv 能够与Pgp 抗原特异结合(图3)。

215　抗体亲和力的测定以放射免疫分析法测定抗PgpScFv 的亲和力,并应用Scatchard 作图法计算亲
和力常数。

K a 为410×108
m ol ΠL (图4)。

216　流式细胞仪测定细胞内Rh123的蓄积流式细
胞仪测定细胞内Rh123的蓄积　1μm ol ΠL 单抗PH M A02与K 562ΠA02共同孵育后测定的相对荧光强度分别为3137%,4μm ol ΠL 抗PgpScFv 与K 562ΠA02共同孵育后测定的相对荧光强度分别为3107%。

阳性对照耐药逆转剂维拉帕咪与K 562ΠA02共同孵育后测定的相对荧光强度为99167%。

实验证明PH M AO2及抗PgpScFv 均不抑制Pgp 泵出Rh123的功能,即不封闭Pgp 的功能(图5)。

3　讨论
一直以来国内外所使用的抗Pgp 单克隆抗体都为鼠
源性单抗,
鼠源单抗作为异种蛋白应用于人体时产
图4　抗PgpScFv 亲和力的测定
Fig.4　Determination of k a for anti 2PgpScFv by Scatch ard
plots
图5　用Rhod amine 123检测抗体对Pgp 泵的抑制作用
Fig.5　The rhod amine 123efflux as a functional test for the Pgp pump in K 562ΠA02cells
N ote :1.K 562ΠA02cells incubated with P BS ;2.K 562ΠA02cells incubated with 113μm ol ΠL rhodamine 123and treated with 1μm ol ΠL PH M A02;3.K 562ΠA02cells
incubated with 113μm ol ΠL rhodamine 123and treated with 4μm ol ΠL anti 2PgpScFv ;4.K 562ΠA02cells incubated with 113μm ol ΠL rhodamine 123and treated with 10μm ol ΠL VRP ;5.K 562cells incubated with 113μm ol ΠL rhodamine 123(alone ).
生的H AM A反应,是限制其应用的重大原因8。

正是由于这一原因,80年代开始进行对鼠源性单抗的人源化改造。

而后又通过基因操作技术制备出基因工程嵌核抗体,力求在保持亲代抗体生物活性的同时,降低免疫原性。

至今为止,人们已研制出多种基因工程抗体,包括单链抗体(ScFv)、Fab抗体片段、F (ab’)2、BsIgG、双价抗体Diabody和Minibody等,它们均具有较低的免疫原性、较好的穿透能力,经过改造还可以获得较高的亲和性,基本上解决了限制鼠源性抗体在体内广泛应用的诸多问题。

其中极有发展前景和很大应用前途的小分子抗体就是ScFv(sin2 gle2chain Fv)。

单链抗体(ScFv)是由接头(linker)将轻链可变区和重链可变区基因以两种取向(V L2 Linker2VH,VH2Linker2V L)连接起来,从而可以构建具有特异性抗原结合功能的小分子片段。

它具有分子量小,穿透能力强,异源性小,构建周期短,表达后的效果好,易于大量生产等优点9。

我们将基因克隆到具有强启动子的PET28C (+)上,表达产物为包涵体,经复性后能特异性地与表达Pgp抗原的K562ΠA02细胞相结合但并不抑制Pgp外排泵的功能。

在所有正常人类组织中均可检测到P2gp及mdr21基因的mRNA,不同器官中的Pgp 及mdr21基因mRNA的水平相差很大,在肾脏、肝、消化道、肺等器官Pgp及mdr21基因mRNA的水平较高,而在睾丸、卵巢、子宫、皮肤等器官处于较低水平10。

即使在同一器官的不同细胞,Pgp及mdr21基因mRNA的水平也有很大差异,而且Pgp在细胞膜的分布并不均一。

例如在肝脏,肝细胞的Pgp及mdr21基因mRNA的水平远低于胆管上皮细胞。

Pgp 在肝细胞的分布则集中于胆小管一侧。

这些研究提示Pgp与正常细胞的分泌功能密切相关。

而且进一步的研究表明,Pgp在血脑屏障、心脏等器官的高表达与毒物及代谢产物的排泄有关,从而保证这些重要器官免受毒物的侵害11,12。

本文构建表达的抗PgpScFv只有针对Pgp抗原的识别功能,并无抑制作用,因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能,无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂,均具有广泛的应用前景。

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[收稿2002212219　修回2003202218
(编辑　许四平)
(上接第262页)
适合作为避孕疫苗普及接种9。

我们的研究证实, pcDNA32hEC D可诱导有效的免疫应答及避孕作用,蛋白加强免疫后可诱导特异性回忆反应,并可增强避孕效果,提示以HER22Πneu为靶点研究避孕疫苗有较好的发展前景。

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[收稿2003207214　修回2003211220
(编辑　许四平)。