中国药典2010年版无菌检查及发展趋势
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——是因在验证试验的实践中，发现作 为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌 在验证试验中对大部分抗生素不敏感， 而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主 的抗生素敏感性较好。
2、验证试验中样品用量的规定：
删除了原：“ 将规定量供试品按… ”
2010年版修订为： 薄膜过滤法验证试验样品量： “ 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜 过滤法过滤。” 直接接种法验证试验样品量： “…其中1管接入每支培养基规定量的供试品量，” —— 明确了验证试验所需样品量是供试品的检 验量而不是供试品的检验数量。
中国药典2010年版无菌 检查及发展趋势
中国医药教育协会 2010年4月29日
WHO的GMP中验证的定义：能证 明任何程序、工艺、设备、物料、 活动或系统，确实能导致预期结果 文件的证明行为。
无菌检查法的现状 及方法学验证回顾
无菌检查现状
2005年版药典重大变化之一是对方法验证进行 了系统的规定；这是我国药品微生物检查方法 迈向科学化、合理化的一个重要标志。
② 验证的理念其实早已贯穿于微生物检测的诸多方 面。
③ 2005年版药典借鉴了发达国家的经验，将微生物 检查方法的验证进行了系统化的规定和要求。
④ 有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性菌 选择不合理，而造成的漏检与误判，这一点无论对于 当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认可、 以其新的药品注册管理办法的要求都是一致的。
2010年版中国药典一、二、三部的 无菌检查法基本延续2005年版。
2010年版中国药典三部逐渐向一、 二部看齐。
增、修订涉及范围
前言部分 培养基部分 培养基灵敏度检查 稀释液、冲洗液 方法验证 薄膜过滤法 培养及观察 结果判断 表1、表2和表3
前言部分
✓新增规定：“防止污染的措施不得影响供试 品中微生物的检出。”
供试品的无菌检查-1
✓1、阳性对照用量：
2005年版：“若采用直接接种法，应增加供 试品1支（或瓶）作阳性对照用。”
2010年版修订为 ：若采用直接接种法，应增 加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样 品量作阳性对照用。
——因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法， 若是固体制剂每管接种量可能不止1支（或瓶 ），应按验证的方法确定。
⑤ 验证也是实验室质量控制的手段。
验证的思路 ？-1
验证体系：阴性对照、阳性对照、微生物 挑战试验；
通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的 活性来检验微生物的方法，应通过验证， 以确定所用检验方法测定结果的可信度；
验证的思路 ？-2
利用供试品与微生物的差异，降低或消除 供试品的影响，通过模拟实验对降低或消 除效果加以检验；
干扰物
戊二醛 酚类、乙醇、吸附物
醛类 季铵类化合物（QACs）、对
羟基苯甲酸酯 汞类制剂
双胍类化合物 碘酒、洗必泰类
卤化物 乙二胺四乙酸（EDTA）
磺胺类 ß-内酰胺类抗生素
可选用的中和剂或灭活方法 亚硫酸氢纳 稀释法
稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、聚山梨酯
亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 卵磷脂 聚山梨酯
剂后面的 “ 如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品） 、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶 （用于β-内酰胺类供试品）”等说明。 修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、 灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
(中和剂、灭活剂见微生物限度检查法中表1）
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
供试品的的无菌检查-2
薄膜过滤法：
1、新增规定：抗生素供试品应选择低吸附的 滤器及滤膜
2、新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不得过 1000ml
通过系统的方法验证促进我国药品微生物检查 标准化建设。
2005年版药典的执行在全国引起了巨大反响！
无菌检查方法学验证回顾
药品微生物检查中的验证试验做一回顾，
主要涉及三个方面内容：
为什么验证？
验证的思路 ？
怎样验证？
为什么验证？
① 采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本要 求，是各种法规遵循的工作基础。
✓新增规定：“日常检验还需要对环境进行监 控。”
✓新增规定：“ 无菌检查人员必须具备微生物 专业知识，并经过无菌技术的培训。”—— 对无菌检查的人员资质提出了要求
培养基部分
✓ 删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧 菌的规定
✓ 删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定 ✓ 删除了选择性培养基项下加入适量中和剂或表面活性
删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过 滤菌丝的无菌毛细吸管） 吸出孢子悬液的操作方
法。
培养基灵敏度检查
新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保 存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应 在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小 时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～ 8℃，在验证过的贮存期内使用。”
稀释液、冲洗液及其制备方法
在原有—— 1. 0.1%蛋白胨水溶液 —— 2. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
的基础上新增加： “可根据供试品的特性，选用其他经验证的
适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。”
方法验证试验
1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基 灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿 假单胞菌，增订了大肠埃希菌。
硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 ß-内酰胺酶
培养基部分
✓将原第 6. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸 链霉素等抗生素的无菌检查） 修订排列为第 4. ——按顺序排列归类培养基1.～4. 均为直接 用于无菌检查的液体培养基。
培养基灵敏度检查
修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法： 规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％ 无菌氯化钠溶液，洗脱孢子及稀释孢子液，制成 每1ml中含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
依据抗菌谱通过预实验确定敏感菌株（阳 性对照菌） 通过敏感菌株确定冲洗量 通过方法验证验证该取样量以及冲洗量下 敏感菌株生长情况 确定试验方案进行 检验。
无菌/微生物限度检查理念
环境保证
培养基保证
无菌性检查 灵敏度检查
SOP操作
Biblioteka Baidu
有效的方法
方法验证
有效的结果 可靠的结论
结果判断
2010版中国药典无菌 检查法的主要增修订情况
2、验证试验中样品用量的规定：
删除了原：“ 将规定量供试品按… ”
2010年版修订为： 薄膜过滤法验证试验样品量： “ 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜 过滤法过滤。” 直接接种法验证试验样品量： “…其中1管接入每支培养基规定量的供试品量，” —— 明确了验证试验所需样品量是供试品的检 验量而不是供试品的检验数量。
中国药典2010年版无菌 检查及发展趋势
中国医药教育协会 2010年4月29日
WHO的GMP中验证的定义：能证 明任何程序、工艺、设备、物料、 活动或系统，确实能导致预期结果 文件的证明行为。
无菌检查法的现状 及方法学验证回顾
无菌检查现状
2005年版药典重大变化之一是对方法验证进行 了系统的规定；这是我国药品微生物检查方法 迈向科学化、合理化的一个重要标志。
② 验证的理念其实早已贯穿于微生物检测的诸多方 面。
③ 2005年版药典借鉴了发达国家的经验，将微生物 检查方法的验证进行了系统化的规定和要求。
④ 有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性菌 选择不合理，而造成的漏检与误判，这一点无论对于 当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认可、 以其新的药品注册管理办法的要求都是一致的。
2010年版中国药典一、二、三部的 无菌检查法基本延续2005年版。
2010年版中国药典三部逐渐向一、 二部看齐。
增、修订涉及范围
前言部分 培养基部分 培养基灵敏度检查 稀释液、冲洗液 方法验证 薄膜过滤法 培养及观察 结果判断 表1、表2和表3
前言部分
✓新增规定：“防止污染的措施不得影响供试 品中微生物的检出。”
供试品的无菌检查-1
✓1、阳性对照用量：
2005年版：“若采用直接接种法，应增加供 试品1支（或瓶）作阳性对照用。”
2010年版修订为 ：若采用直接接种法，应增 加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样 品量作阳性对照用。
——因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法， 若是固体制剂每管接种量可能不止1支（或瓶 ），应按验证的方法确定。
⑤ 验证也是实验室质量控制的手段。
验证的思路 ？-1
验证体系：阴性对照、阳性对照、微生物 挑战试验；
通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的 活性来检验微生物的方法，应通过验证， 以确定所用检验方法测定结果的可信度；
验证的思路 ？-2
利用供试品与微生物的差异，降低或消除 供试品的影响，通过模拟实验对降低或消 除效果加以检验；
干扰物
戊二醛 酚类、乙醇、吸附物
醛类 季铵类化合物（QACs）、对
羟基苯甲酸酯 汞类制剂
双胍类化合物 碘酒、洗必泰类
卤化物 乙二胺四乙酸（EDTA）
磺胺类 ß-内酰胺类抗生素
可选用的中和剂或灭活方法 亚硫酸氢纳 稀释法
稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、聚山梨酯
亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 卵磷脂 聚山梨酯
剂后面的 “ 如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品） 、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶 （用于β-内酰胺类供试品）”等说明。 修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、 灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
(中和剂、灭活剂见微生物限度检查法中表1）
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
供试品的的无菌检查-2
薄膜过滤法：
1、新增规定：抗生素供试品应选择低吸附的 滤器及滤膜
2、新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不得过 1000ml
通过系统的方法验证促进我国药品微生物检查 标准化建设。
2005年版药典的执行在全国引起了巨大反响！
无菌检查方法学验证回顾
药品微生物检查中的验证试验做一回顾，
主要涉及三个方面内容：
为什么验证？
验证的思路 ？
怎样验证？
为什么验证？
① 采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本要 求，是各种法规遵循的工作基础。
✓新增规定：“日常检验还需要对环境进行监 控。”
✓新增规定：“ 无菌检查人员必须具备微生物 专业知识，并经过无菌技术的培训。”—— 对无菌检查的人员资质提出了要求
培养基部分
✓ 删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧 菌的规定
✓ 删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定 ✓ 删除了选择性培养基项下加入适量中和剂或表面活性
删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过 滤菌丝的无菌毛细吸管） 吸出孢子悬液的操作方
法。
培养基灵敏度检查
新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保 存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应 在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小 时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～ 8℃，在验证过的贮存期内使用。”
稀释液、冲洗液及其制备方法
在原有—— 1. 0.1%蛋白胨水溶液 —— 2. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
的基础上新增加： “可根据供试品的特性，选用其他经验证的
适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。”
方法验证试验
1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基 灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿 假单胞菌，增订了大肠埃希菌。
硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 ß-内酰胺酶
培养基部分
✓将原第 6. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸 链霉素等抗生素的无菌检查） 修订排列为第 4. ——按顺序排列归类培养基1.～4. 均为直接 用于无菌检查的液体培养基。
培养基灵敏度检查
修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法： 规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％ 无菌氯化钠溶液，洗脱孢子及稀释孢子液，制成 每1ml中含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
依据抗菌谱通过预实验确定敏感菌株（阳 性对照菌） 通过敏感菌株确定冲洗量 通过方法验证验证该取样量以及冲洗量下 敏感菌株生长情况 确定试验方案进行 检验。
无菌/微生物限度检查理念
环境保证
培养基保证
无菌性检查 灵敏度检查
SOP操作
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有效的方法
方法验证
有效的结果 可靠的结论
结果判断
2010版中国药典无菌 检查法的主要增修订情况