小分子协助超高压脲包法富集亚麻籽油中PUFA

第一章绪论
1.1 课题研究目的与意义
亚麻籽油含丰富的不饱和脂肪酸，见表 1.1，其中以亚油酸和亚麻酸为主的多不饱和脂肪酸（poly unsaturated fatty acids, PUFA）含量高达60%以上[1]。

亚油酸和亚麻酸是人体必需脂肪酸，其在治疗皮炎、风湿性关节炎、心血管疾病、高血压、哮喘、过敏症和抑制肿瘤生长方面具有一定功效[2-5]。

且二者相互依存，相互联系，共同调节生物体的生命活动[6]。

因此，亚麻籽油中亚油酸和亚麻酸分离纯化或富集研究尤为重要。

现有研究对PUFA分离采用尿素包合法，这种方法需在冷冻条件下包合20h以上[7,8]，设备简单、易操作、得到的PUFA纯度较高，但是存在包合时间长、产品收率低、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）与PUFA选择性差等缺点。

本课题拟用超高压结晶改进传统的冷冻包合法，缩短包合时间、提高分离效率，并通过小分子协同改进不饱和脂肪酸的分离选择性。

该研究对于高纯度多不饱和脂肪酸的制备具有重要指导意义。

表 1.1 亚麻籽油中主要脂肪酸组成、结构及含量
Tab 2.1 The main component contain and structure in flaxseed oil 名称简写结构含量(%) 棕榈酸C16：0 CH3(CH2)14COOH 3.7~7.9 硬脂酸C18：0 CH3(CH2)16COOH 2.0~6.5 油酸C18：1 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 13.0~39.0 亚油酸C18：2 CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3(CH2)3COOH 12.0~30.0 亚麻酸C18：3 CH3CH2 (CH=CHCH2)3(CH2)6COOH 39.0~62.0 1.2国内外研究现状
1.2.1PUFA分离常用方法
混合脂肪酸组分分子间存在特殊的氢键作用力，汽化温度较高，属于低挥发性、高沸点的热敏性物质，尤其是PUFA各组分间物理性质差异较小，饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸以及单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸分离较困难[9,10]。

目前分离纯化PUFA的方法有：分子蒸馏法、超临界流体萃取技术、脂肪酶浓缩法、银离子络合法、冷冻结晶法、尿素包合法。

1.2.1.1 分子蒸馏法
分子蒸馏法是在绝对压强1.33Pa~0.0133Pa的高真空条件下，利用混合脂肪
酸各组分挥发性的不同而使其分离[11]。

傅红[12]等用多级分子蒸馏法提取深海鱼油中PUFA，通过控制压力和温度得到PUFA含量不同的各级鱼油产品，其中高碳链不饱和脂肪酸质量分数最高可达90.96%，且各理化指标均合格；徐世民[13]等用分子蒸馏法富集海狗油中的PUFA，通过一级分子蒸馏法，控制适宜的温度和压力，得到EPA、DPA 和DHA 的质量分数为54.86%的海狗油产品，收率为92.7%；Zhang[14]等用分子蒸馏法富集沙棘籽油中的不饱和脂肪酸，通过响应面试验优化得到不饱和脂肪酸含量和得率分别为82.38%、62.59%。

分子蒸馏法蒸馏温度低，适合分离受热易发生氧化的不饱和脂肪酸，例如深海鱼油、海狗油等，但此方法有一定的适用局限性，且需要较高的真空度，能耗较大。

1.2.1.2 超临界流体萃取技术
超临界流体萃取技术是通过控制温度和压力使得混合脂肪酸各组分在超临界流体中溶解度发生较大变化，从而实现混合脂肪酸的分离。

刘小莉[15]利用超临界CO2萃取黑莓籽油，从萃取压力、分离罐压力、萃取罐温度及萃取时间因素优化出最佳工艺条件，在此条件下，从黑莓籽油中萃取出的不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸和亚麻酸）含量为78.18%，得率为（17.73±0.19）%；Weber[16]采用超临界CO2流体萃取法分离混合油（玉米油和鱼油）中不同饱和程度的混合脂肪酸乙酯，在优化后的工艺条件下，饱和及单不饱和脂肪酸优先反应生成甘油酯，与未发生反应的乙基酯部分实现良好的分离。

肖丰坤[17]等用正交实验法优化超临界CO2萃取工艺，得出滇牡丹籽油中亚油酸和亚麻酸的含量为89.34%，萃取率为27.34%。

由于超临界流体萃取技术的萃取剂常选用CO2，故此方法可以保护不饱和脂肪酸使其不被氧化，但得率普遍偏低，在一定程度上造成资源的浪费，且不容易分离碳链长度相近的脂肪酸。

1.2.1.3 脂肪酶浓缩法
由于脂肪酶会对混合脂肪酸甘油酯进行选择性水解，所以可以用来分离水解速度不同的混合脂肪酸。

蔡秋生[18]用脂肪酶酯化法精制金枪鱼油中DHA，使其含量由24%增加到72%，用相同的方法进行二次精制，得到DHA含量为91%，回收率达60%；Haraldsson[19]用脂肪酶催化酯化法从鱼油中提取EPA和DHA，二者总含量由24%提高至约50%，回收率分别为80%和90%。

脂肪酶浓缩法酶催化效率高，反应条件温和，但反应过程中水解、酯化等反应环境复杂，且可逆反应不宜控制反应方向。

1.2.1.4 银离子络合法
银离子可以与不饱和脂肪酸中的双键形成亲水性的极性络合物，双键越多，结合力越强，形成的络合物越稳定，而饱和脂肪酸及饱和度低的脂肪酸则留在油相中，故可以根据脂肪酸中双键的个数分离混合脂肪酸。

靳革[20]等用银离子络
合法富集核桃油中的不饱和脂肪酸甲酯，将不饱和脂肪酸含量由72.3%增加到96.3%；司秉坤[21]等用银离子络合法分离纯化亚麻籽中α-亚麻酸，α-亚麻酸纯度为97.53%，得率不足10%。

此方法的优点是分离效果较好，获得的不饱和脂肪酸纯度较高，但产品产量小、成本高、重金属回收率低且污染严重，不适宜大规模生产。

1.2.1.5 冷冻结晶法
冷冻结晶法是根据在低温条件下不同的脂肪酸在有机溶剂（常用丙酮、乙醇等）中溶解度不同而实现分离的。

冷冻结晶法工艺简单、操作过程方便，低温环境下可保护不饱和脂肪酸不被氧化，但也有文献报道低温结晶法的分离效率较差[22]，经常与其他方法联合使用才能达到较好的分离效果。

1.2.1.6 尿素包合法
在温度较低的环境下，溶解在有机溶剂中的尿素分子易与饱和或单不饱和脂肪酸形成较稳定的晶体包合物，而多不饱和脂肪酸由于双键具有一定的空间结构，弯曲折叠复杂，不易被尿素包合，采用过滤即可将不同的脂肪酸分离。

尿素包合法的主要影响因素有尿素用量、结晶温度、结晶时间和包合次数等[23]。

1.2.2 尿素包合法分离混合脂肪酸研究进展
尿素包合法用于脂肪酸的分离效果受结晶温度和尿素用量的影响，结晶温度越低，尿素用量越多，所得产品纯度越高，得率越低，故现行尿素包合法一般研究不同因素对包合效果的影响，并通过优化包合工艺来提高产品的纯度和得率。

紫苏油中α-亚油酸纯化时采用的包合温度-20˚Ｃ，包合时间为690 min [24]；油茶籽中油酸的制备时采用的尿素包合条件为：4˚C保存16h，其油酸纯度由80%提高至92%，回收率达83% [25]；疯树籽油中的饱和与不饱和脂肪酸分离时，尿素与脂肪酸甲酯（w/w）比为0.75:1，包合温度10℃，包合时间20 h，非包合相不饱和脂肪酸从75.88%提高到95.95%；麻疯树籽油中脂肪酸与尿素比例为1:5（w/w），在-10℃下包合24 h，非包合物相中亚油酸含量达92.81%，收率仅7.8%[26]；刘卓华[27]用尿素包合法富集金枪鱼中的EPA和DHA时，总浓度达85.02%，收率为25.10%；何文兵[28]用尿素包合法富集燕麦麸中不饱和脂肪酸，脂肪酸/尿素/乙醇（w/w/w）为1:3:9，0℃条件下包合12 h，此条件下不饱和脂肪酸含量由原来的40.66%提高至91.8%，得率为15.6%。

葵花籽油中混合脂肪酸在4℃下包合10 h，非包合相中亚油酸含量从原料中40%提至70.07%，但仍有27.91%油酸未被包合除去,而尿素包合物中除包合53.70%油酸外，仍有27.73%亚油酸被非选择性包合[29]。

也有研究表明多次包合可提高产品的纯度，如月见草油中γ-亚麻酸分离的最佳包合条件为-15 ˚C，60 h，包合3次，其γ-亚麻酸纯度可达79%，收率为57%[30]；刘凤霞[31]等对尿素包合法的工艺进行优化后，3次包合将月见草油
中的亚麻酸纯度从7~8%提高到90%以上，且包合3次、4次、5次的纯度并无显著性差异；李炜[32]等用尿素包合法对栀子油中的亚油酸进行富集，分3次包合，在不同的温度条件下分别包合12h、8h、5h，亚油酸纯度由55~60%增加到90.08%。

以上研究可以看出脲包法对设备要求简单、易操作，但常需在低温冷却条件下包合，存在包合时间长、产品收率低、单不饱和脂肪酸与PUFA选择性差等缺点，加之大量尿素和溶剂使用，造成溶剂回收成本高，产品中有机溶剂残留不易去除，为此，一些研究者对传统的包合过程加以改进，或联合其它手段对传统单一的尿素包合法进行改性与提高。

1.2.3 对传统脲包法改进措施研究进展
1.2.3.1传统脲包法过程改进
现尿素包合法分离混合脂肪酸大多是在传统包合法的基础上对尿素脂肪酸比例、包合温度、包合时间等因素进行工艺优化，提高其中一种脂肪酸的纯度，也有研究者将冷却结晶过程中温度因素进行详细的分析，Maria K B[33]研究表明尿素包合物晶体形成和不稳定的温度均在尿素熔点附近；Mary[34]用两种不同的主体分子包合相同的客体发现：在尿素包合物中，熵和焓的变化共同影响尿素包合物的形成和尿素包合物晶体熔化后液体的性质；Hayes[35]研究了冷却速率对晶体形态和大小的影响，结果表明：当缓慢降温和快速降温时，两种尿素包合物晶体的形态无差别，但大小有明显的区别，当非包合相中游离脂肪酸的回收率大于60%时，饱和与多不饱和脂肪酸的选择性不受冷却速率的影响，但当回收率较低时，缓慢降温会增加多不饱和脂肪酸的纯度。

在尿素包合物结晶规律的基础上，一些学者对尿素包合物结晶工艺加以改进，在冷却工艺方面，Gu等[24]采用梯度冷却脲包法来提纯紫苏籽油中PUFA，α-亚麻酸含量由49%提高到90%以上；王车礼等[36]以搅拌梯度冷却替代传统静置冷却分离脂肪酸甲酯，其冷却结晶周期由5 ℃/18 h缩短至10 ℃/1 h左右。

以上改进措施在不饱和脂肪酸分离周期上有一定提高。

1.2.3.2 其它方式协同脲包法纯化PUFA
通过改进脲包法工艺参数或工艺步骤，一定程度上可以提高PUFA分离效率，但采用单一方法较难得到高纯度、高得率的PUFA，而且易受工艺条件的限制使得在实际应用中有一定的局限性，因此可采用其它方法辅助脲包法分离富集PUFA，以提高PUFA分离效率和分离选择性，并达到大规模工业化生产的目的。

（1）超声波辅助法
有学者研究超声功率和超声时间对脂肪酸组成和含量的影响，结果当超声温度在50 ℃以下、超声功率≤900 W、超声时间小于 1 h 时，超声处理对红花籽
油脂肪酸组成没有影响，但对脂肪酸含量有较小的影响[37]。

张正红[38]根据超声波的空化作用原理，采用超声尿素包合法富集大庆减压馏分油中的正构烷烃，研究了活化剂、稀释溶剂、尿素用量、包合温度、超声时间等因素对正构烷烃富集效果的影响，优化出最佳工艺条件，超声包合20 min 即可将正构烷烃的收率提高到42.51%。

简化了反应操作步骤、缩短了反应时间，但得到的正构烷烃产品中也有部分非正构烷烃。

有研究者首先采用超声波法提取脂肪酸，再用脲包法进一步分离纯化PUFA。

例如：韩玉玺[39]采用超声波辅助提取GLA，用脲包法纯化GLA并确定其最佳工艺条件，考察液料比、超声时间及超声功率对GLA产量的影响，并采用二次旋转组合设计响应面分析，得出最优提取工艺，得率为899.26 mg/L，后继续采用尿素包合法纯化GLA，用正交实验优化出包合反应的最佳条件：脲脂比4:1(w/w)、脂肪酸:乙醇为1:12(w/w)、包合温度为-25℃、包合时间12 h，GLA含量为47.1%；曲星源[40]通过响应面法优化超声波提取紫菜中脂肪酸的工艺，粗脂肪含量最高为（7.36±0.026）%，再利用尿素包合法富集纯化EPA-DHA，通过单因素分析尿素脂肪酸比例、包合温度及包合时间对DHA富集效果的影响，结果得出EPA 和DHA的含量分别为45.27%和46.19%。

（2）溶剂结晶辅助法
白希[41]把溶剂结晶法和尿素包合法相结合富集伽师瓜籽油中的亚油酸，将亚油酸的纯度由原油中的62.56%提高到99.53%，产率为50.86%；安腾奇[42]将溶剂结晶和尿素包合法联用，从24度精炼棕榈油水解脂肪酸中分离提纯油酸，溶剂结晶优化后的最佳条件为：无水乙醇/混合脂肪酸(w/w)＝2:1，-10 ℃结晶10 h；尿素包合的最佳条件为：原料酸/尿素/无水乙醇（w/w/w）比为1:2:10，包合温度10 ℃，包合时间6 h，通过溶剂结晶和尿素包合法相结合，油酸的纯度43.74%为87.56%，总得率为38.65%。

（3）超临界流体萃取辅助法
T J Lin以鲱鱼油为研究对象，将超临界CO2萃取法与尿素包合法联用，并采用固定化酶催化反应富集其中的n-3 PUFA，含量为71.2%（其中EPA为29.4%，DHA为41.8%），得率为80.1%[43]；李毅丽[44]以玉米油为研究对象，利用超临界CO2流体萃取精馏技术，通过单因素试验后并优化，可使亚油酸含量达到69.70%，在此基础上结合尿素包合法继续纯化亚油酸，在单因素试验的基础上进行响应面分析得出最优工艺：醇尿比(v/w)为5.5、尿脂比(w/w)为6.3、在14℃包合14.5 h，得到亚油酸含量和回收率分别为97.13%、45.53%；曲晓宇[45]等通过超临界CO2流体萃取法提取东北柞蚕蛹油中的PUFA，并用尿素包合法对蚕蛹油中混合脂肪酸进一步纯化，结果SFE-CO2萃取后PUFA（油酸、亚油酸和α-亚麻酸）的含量
为22.73%，在脂肪酸/尿素/甲醇(w/w/v)=1:3:10、-10℃包合18 h条件下，纯度达到84.08%，再次包合后纯度达95.70%；
（4）低温协同超高压脲包法
潘见[46]等人研究发现超高压脲包技术可以有效的提取植物油脱臭馏出物中的脂肪酸、VE、角鲨烯等功能性物质，且超高压脲包工艺对脂肪酸损害较小，与传统脲包法相比，超高压脲包法大大的缩短了包合时间（20 h→1 h）；袁野[47]等采用低温协同超高压脲包法分离馏出物中饱和脂肪酸，即4℃冷藏90 min后再施以300 Mpa压力，产品中不饱和脂肪酸脂肪酸乙酯的含量从37.65%提高到60.01%，同时饱和脂肪酸乙酯总量从15.22%减少到2.83%。

这也初步说明高压脲包法有望提高传统脲包法的结晶分离周期。

（5）羧酸分子辅助法
Hayes[48]总结尿素可以与一些小分子形成不同螺旋结构的尿素包合复合物，例如双羧酸或过氧化氢；国内李奇曾将许多不同种类的阴离子（如：NO3-、CO32-及一些单羧酸和双羧酸等）引入尿素/硫脲/硒脲制备一系列尿素/硫脲/硒脲-阴离子主体晶格包合物[49]，这些新复合主体晶格改变了尿素衍生物作为单一主体分子的现状，改变了包合物中简单的一维管状结构。

当在油酸存在下，维甲酸或辛伐他汀可顺利插入尿素-油酸晶格中，从而形成维甲酸-尿素-油酸[50]或辛伐他汀-尿素-油酸[51]共晶而改善溶解度；酒石酸与尿素可形成有序的二维阴离子网络结构[52]，并且有报道显示酒石酸-尿素-脂肪酸（酒石酸/尿素= 1：2）形成的包合物的尺寸大于尿素-脂肪酸，且利用此包合物可在结晶温度-8 ˚C，3 h富集到90.4%的亚油酸，收率达82.0%[53]。

1.3主要研究内容
本课题围绕尿素包合法富集PUFA时，针对包合时间长、PUFA得率低问题引入超高压协同传统脲包法以缩短包合时间，目前有文献报道施加一定的压力可使2,10-十一烷二酮/尿素包合物的结构发生一些微小的变化[54]，且高压处理对饱和脂肪酸影响较不饱和脂肪酸更为显著[55]，潘见[46]等人研究发现超高压脲包法提取植物油脱臭馏出物中的脂肪酸、VE、角鲨烯等功能性物质，缩短了包合时间（20h→1h），且超高压脲包工艺对脂肪酸损害较小。

这也初步说明超高压技术有望提高PUFA的包合效率。

因此，本研究采用超高压脲包法来改变包合过程，并通过研究在不同包合条件下包合物晶体的变化规律，解释超高压脲包法的机理。

有报道显示添加一些其它物质（如：十一烷-2-酮）能在一定程度上改变包合物的管道尺寸[54]，且酒石酸-尿素-脂肪酸（酒石酸/尿素= 1：2）形成的包合物的尺寸大于尿素-脂肪酸[53]，那么能否通过添加羧酸类小分子来调控尿素包合体系的管道尺寸，进而改善单不饱和脂肪酸与PUFA的分离选择性，为此本研究对
羧酸类小分子进行试验并筛选，确定比较合适的羧酸小分子进行辅助脲包法包合，最终确定包合工艺。

本研究主要内容如下：
1.超高压脲包法分离富集PUFA研究。

2.羧酸小分子协同低温脲包法影响PUFA分离选择性研究。

3. 柠檬酸协同超高压脲包法二次包合的工艺路线确定。