GCMS方法检测全血中15种农药残留
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▪ 在我国急性和慢性中毒时有发生，为确定突发化学中毒事件的性 质，需要我国人群除草剂残留量的背景值作为定性的参考依据。
▪ 因此，作为国家科技支撑计划课题(2006BAI06B02)的一部分，为 下一步建立常用除草剂人群残留量的参比值和全国范围的具有代 表性的生物样品库提供技术支持和可靠数据。
▪ 该方法较目前常用方法灵敏度有很大提高，适用于血液中农药含 量较低的样品检测。
标准保护剂溶液的配置
❖ 准确称取100mg古洛糖酸内酯，用甲醇定容稀释至50ml 容量瓶中，轻轻震荡混匀，即配制成浓度为2mg/ml的保 护剂溶液；
❖ -4℃低温保存。
标准液的配置
根据各化合物的灵敏度不同，使用保护剂溶液配置标准溶液和标准系列，各化合 物浓度水平(μg/L )如下：
化合物 名称 扑草净 马拉硫磷 丁草胺 联苯菊酯 α-硫丹 β-硫丹 乐果
保护剂的作用
❖ 根据相关参考文献，对保护剂用于补偿基质效应进行了 研究，认为古洛糖酸内酯(Gulonic acid γ- lactone)具有 良好的补偿作用。
❖ 适量的古洛糖酸内酯对农药有较好的保护作用，能够有 效地补偿因系统中存在的活性位点引起的基质干扰效应 ，明显改善峰型，提高灵敏度和定量的准确性。
▪ 信号噪声较大，影响积分和定量 ▪ 运行时间较长，浪费时间
❖ 因此本次实验采用中等极性的DB-35的毛细管柱，是综 合考虑各方面因素的决定的。结果证明分离效果比较理 想。
进样方式的选择
❖ 进样方式
▪ 不分流进样 ▪ 脉冲不分流进样 ❖ 为提高灵敏度，增加化合物的进样量，采用脉冲不分流 进样，会得到较好效果。
质谱扫描离子选择的原则
（一）尽量选择主要离子碎片； （二）定量定性离子不能低于2个； （三）尽量避开基质成分中相同保留时间段上也存在的干
就能满足回收率要求，只是毒性较大，操作时需谨慎。
保护剂的使用
❖ 在采用GC和GC-MS对不同样品进行农药残留检测分析时， 经常会发现有些待分析物灵敏度较低，或是峰型很差，拖 尾严重，积分结果偏差较大。
❖ 这些现象可能是由待分析物在进样口的高温环境中降解产 生，或是待分析物在进样系统的活性位点滞留引起的向毛 细管移动减慢导致的。
第一水平
4 4 4 4 20 20 40
第二水平
8 8 8 8 40 40 80
第三水平
20 20 20 20 100 100 200
第四水平
40 40 40 40 200 200 400
第五水平
80 80 80 80 400 400 800
标准液的配置
根据各化合物的灵敏度不同，使用保护剂溶液配置标准溶液和标准系列，各化合 物浓度水平(μg/L )如下：
❖ 注：转移过程中一定要缓慢，以免将其他杂质一同倒入 试管中。
样品处理（3）
❖ 氮吹浓缩、微量定容
❖ 将存有提取液的试管在浓缩仪上吹至近干后，用150μl 甲醇保护剂溶液溶解，最大转速涡旋振荡2min，移入含 有250μl内插管的进样小瓶中，供气相色谱-质谱联用仪 检测。
❖ 在氮吹浓缩的过程中要注意氮气的流速不能太快，以免 导致目标化合物的丢失，但也不宜太慢，会浪费时间。 浓缩过程中温度控制在50℃，吹干时间控制在10min。
扰离子； （四）尽量回避柱流失离子碎片。
运行时间的确定
对血液样品进行农药残留测定时，一定要注意，除了目 标化合物以外其他化合物的保留时间，例如胆固醇的保 留时间明显晚于待测化合物，如果第一次进样没有运行 完全，将会在以后的进样中出现鬼峰，而且是保留时间 不定，会影响定量。
方法总结
❖优点
▪ 灵敏度较高、定量下限较低、操作简单、成本低 ▪ 应用范围较宽，包含常用的四大类15种常用农药，有
GCMS方法检测全血中15种 农药残留
主要内容
1
研究背景
2
应用范围
3
材料与方法
4
实验结果
35
结果讨论与分析
研究背景
▪ 大量研究表明，农药在大量使用后会在环境中存在一定的残留， 农药的化学性质和使用量不同，残留的量也不同。在国内外研究 中，关于农药在生物样本中的残留主要集中在有机氯、有机磷、 拟除虫菊酯类和除草剂四大类。
❖ 根据相关文献和本次实验验证结果，采用低温冷冻的方法 ，可以有效破除乳化现象，提高离心后提取溶剂的回收量 ，从而可以有效提高回收率。
❖ 通过多次实验结果认为，在温度低于20℃持续冷冻大于 20min时，溶剂回收效果较好。在本次实验中加入6ml提 取溶剂回收量≥5ml。因此也提高了目标化合物的回收率 。
选择离子参数
定量离子 173 176 375 241 241 181 181 181
定性离子
173 、127 176 、160 375 、373 241 、265 241 、265 181 、166 181 、265 181 、208
实验结果
1
方法的 线性关系、 检出限、 定量下限
2
方法的 准确度、 精密度
保持0.00min） 10℃/min 280℃（保持4.00min） 20℃/min 320℃（保持6.00min）共23min。 ❖ 进样量：1μl； ❖ 进样方式：脉冲不分流进样 / 不分流进样；
质谱条件
❖ 电离电压：70eV； ❖ 溶剂延迟：6.5min； ❖ 离子源温度：230℃； ❖ 四极杆温度：150℃；
▪ 甲醇、二氯甲烷 ▪ 15种农药标准品（甲拌磷、二嗪农、阿特拉津、
乐果、2,4-D丁酯、扑草净、马拉硫磷、甲基对 硫磷、丁草胺、氯丹、α-硫丹、β-硫丹、联苯菊 酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯） ▪ 保护剂古洛糖酸内酯（sigma试剂公司99.75%）
仪器
▪ Angilent 6890-5973气相色谱-质谱联用仪 ▪ 色谱柱 DB-35MS（30m×0.25mm×0.25μm） ▪ 浓缩仪（氮气吹干） ▪ 涡旋振荡器（转速可调节） ▪ 超声仪 ▪ 离心机
化合物名称 第一水平
甲拌磷
10
二嗪农
10
阿特拉津
10
2,4-D丁酯
10
甲基对硫磷
10
氯丹
10
甲氰菊酯
10
三氟氯氰菊酯 10
第二水平 20 20 20 20 20 20 20 20
第三水平 50 50 50 50 50 50 50 50
第四水平 第五水平
100
200
100
200
100
200
100
200
保护剂使用量的确定
超声提取方法的确定
❖ 在采用液液提取时，加入有机溶剂后，在涡旋混匀过程 中会发生严重的乳化现象，涡旋振荡提取回收率普遍较 低，溶剂回收体积也只能达到加入量的1/2，通过实验发 现，涡旋震荡发生乳化后，再采用超声辅助提取可以明 显提高回收率，但仍无法达到检测要求，主要是溶剂回 收率低的问题仍然没有改善。
色谱、质谱条件
色T谱ex柱t 载气
进样口温度 进样量
进样方式 色谱程序
仪器检测方法 色谱、质谱条件
电离Te电t 压 溶剂延迟 离子源温度 四级杆温度 扫描模式
色谱条件
❖ 色谱柱：DB-35MS（30m×0.25mm×0.25μm）； ❖ 载气：高纯氦气，流速1ml/min； ❖ 进样口温度：280℃； ❖ 色谱程序：120℃（保持1.00min） 20℃/min 240℃（
色谱柱的选择
❖ 根据大多文献农药检测大多使用HP-5或DB-5的毛细管 柱，但本次实验欲测定的化合物机极性范围较宽，而且 其中含有极性较大、检测过程中较不稳定的有机磷类农 药，在检测过程中这些化合物会有轻度拖尾现象。
❖ 另外，样品中还含有大量的脂肪酸、油酸、胆固醇等非 极性化合物，采用非极性柱或是极性较大的毛细管柱， 分离效果都不理想。
❖ 放入清洗超声仪中超声辅助提取20min。
样品预处理（2）
❖ 冷冻破乳、离心分层
❖ 将超声后的试管放入-20℃以下的冰箱中冷冻20-30min 。
❖ 冷冻后取出放置至完全融化后，用高速离心机以 3000rpm离心15min，至完全分为三层。
❖ 将上层液体倒入废液池内，用一只未使用过的空白吸管 将中间层固体（沉淀蛋白）轻轻挤压到试管一侧，然后 将下层提取液全部转移至另一支洁净普通玻璃试管中。
综合考虑
液液提取
固相萃取
提取方法的确定
❖ 固相萃取
❖ Agilent C18： 2,4-D丁酯和联苯菊酯回收率较低 ❖ Oasis HLB C18固相萃取小柱 ❖ 氨基柱 ❖ 苯基柱 ❖ 氧化铝柱
提取方法的确定
❖ 液液提取
❖ 正己烷 ❖ 乙酸乙酯 ❖ 正己烷-乙酸乙酯 ❖ 正己烷-乙腈 ❖ 二氯甲烷：提取回收率效果较好，且只需要一次提取，
化合物名称
甲拌磷 二嗪农 阿特拉津 乐果 2,4-D丁酯 扑草净 甲基对硫磷
选择离子参数
定量离子 260 179 200 125 276 241 109
定性离子
260、231 179、304 200 、215 125 、229 276 、162 241 、184 109 、125
化合物名称
马拉硫磷 丁草胺 氯丹 α-硫丹 β-硫丹 联苯100
200
100
200
100
200
样品预 处理 方法
涡旋震荡、超声提取 冷冻破乳、离心分层 氮吹浓缩、微量定容 移除浓缩液，供仪器检测
样品预处理（1）
❖ 涡旋震荡、超声提取
❖ 将加有1.5ml全血的螺口具塞15ml试管中，缓慢加入6ml 二氯甲烷。
❖ 在涡旋振荡器上涡旋振荡5min（即使发生乳化现象，仍 要继续震荡），转速以液面不接触到试管塞为准。
利于中毒化合物的定性 ▪ 适用于低剂量中毒或是慢性中毒的预防和筛检 ▪ 作为国家科技支撑计划课题(2006BAI06B02)的一部
分，为下一步建立常用农药人群残留量的参比值和全 国范围的具有代表性的生物样品库提供技术支持和可 靠数据。
❖缺点
方法总结
▪ 样品中存在的大量类脂、胆固醇、胆淄二烯等物质没 有有效去除，对仪器污染较大，处理大量样品时，最 好加入气体反吹装置。
❖ 要注意的是，在采取超声措施时，提取容器要使用具塞 玻璃试管，最好是螺口耐有机溶剂的玻璃试管，因为玻 璃试管可以有效传递超声能量，而且在超声过程中，产 生的热量会导致容积蒸汽压增大，以至会冲出普通试管 塞。
冷冻破乳方法的应用
❖ 在采用溶剂液液提取过程中，由于乳化现象的产生，会影 响溶剂的回收量，例如加入6ml有机溶剂，高速离心后只 能取出3ml，甚至更少。这会直接影响目标化合物的提取 效率。
离子选择扫描模式图谱
结果讨论与分析
样品提取净化 条件的优化
保护剂的应用 仪器条件的优化
提取方法的确定 超声提取方法的确定 冷冻破乳方法的应用 确定提取溶剂体积
保护剂的效果评价及 用量的确定
色谱柱的选择
进样方法的选择
定量定性离子的选 择和分组分段扫描
模 式的确定
运行时间的确定
结果讨论与分析
提取方法的确定
应用范围
▪ 人血液中15种常用农药的样品提取方法和GC/MS定性、定 量检测方法。
▪ 有机磷农药
• 甲拌磷、二嗪农、阿特拉津、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷
▪ 有机氯农药
• 氯丹、a-硫丹、b-硫丹
▪ 拟除虫菊酯类农药
• 联苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯
▪ 除草剂
• 2,4-D丁酯、扑草净、丁草胺
试剂
▪ 因此，作为国家科技支撑计划课题(2006BAI06B02)的一部分，为 下一步建立常用除草剂人群残留量的参比值和全国范围的具有代 表性的生物样品库提供技术支持和可靠数据。
▪ 该方法较目前常用方法灵敏度有很大提高，适用于血液中农药含 量较低的样品检测。
标准保护剂溶液的配置
❖ 准确称取100mg古洛糖酸内酯，用甲醇定容稀释至50ml 容量瓶中，轻轻震荡混匀，即配制成浓度为2mg/ml的保 护剂溶液；
❖ -4℃低温保存。
标准液的配置
根据各化合物的灵敏度不同，使用保护剂溶液配置标准溶液和标准系列，各化合 物浓度水平(μg/L )如下：
化合物 名称 扑草净 马拉硫磷 丁草胺 联苯菊酯 α-硫丹 β-硫丹 乐果
保护剂的作用
❖ 根据相关参考文献，对保护剂用于补偿基质效应进行了 研究，认为古洛糖酸内酯(Gulonic acid γ- lactone)具有 良好的补偿作用。
❖ 适量的古洛糖酸内酯对农药有较好的保护作用，能够有 效地补偿因系统中存在的活性位点引起的基质干扰效应 ，明显改善峰型，提高灵敏度和定量的准确性。
▪ 信号噪声较大，影响积分和定量 ▪ 运行时间较长，浪费时间
❖ 因此本次实验采用中等极性的DB-35的毛细管柱，是综 合考虑各方面因素的决定的。结果证明分离效果比较理 想。
进样方式的选择
❖ 进样方式
▪ 不分流进样 ▪ 脉冲不分流进样 ❖ 为提高灵敏度，增加化合物的进样量，采用脉冲不分流 进样，会得到较好效果。
质谱扫描离子选择的原则
（一）尽量选择主要离子碎片； （二）定量定性离子不能低于2个； （三）尽量避开基质成分中相同保留时间段上也存在的干
就能满足回收率要求，只是毒性较大，操作时需谨慎。
保护剂的使用
❖ 在采用GC和GC-MS对不同样品进行农药残留检测分析时， 经常会发现有些待分析物灵敏度较低，或是峰型很差，拖 尾严重，积分结果偏差较大。
❖ 这些现象可能是由待分析物在进样口的高温环境中降解产 生，或是待分析物在进样系统的活性位点滞留引起的向毛 细管移动减慢导致的。
第一水平
4 4 4 4 20 20 40
第二水平
8 8 8 8 40 40 80
第三水平
20 20 20 20 100 100 200
第四水平
40 40 40 40 200 200 400
第五水平
80 80 80 80 400 400 800
标准液的配置
根据各化合物的灵敏度不同，使用保护剂溶液配置标准溶液和标准系列，各化合 物浓度水平(μg/L )如下：
❖ 注：转移过程中一定要缓慢，以免将其他杂质一同倒入 试管中。
样品处理（3）
❖ 氮吹浓缩、微量定容
❖ 将存有提取液的试管在浓缩仪上吹至近干后，用150μl 甲醇保护剂溶液溶解，最大转速涡旋振荡2min，移入含 有250μl内插管的进样小瓶中，供气相色谱-质谱联用仪 检测。
❖ 在氮吹浓缩的过程中要注意氮气的流速不能太快，以免 导致目标化合物的丢失，但也不宜太慢，会浪费时间。 浓缩过程中温度控制在50℃，吹干时间控制在10min。
扰离子； （四）尽量回避柱流失离子碎片。
运行时间的确定
对血液样品进行农药残留测定时，一定要注意，除了目 标化合物以外其他化合物的保留时间，例如胆固醇的保 留时间明显晚于待测化合物，如果第一次进样没有运行 完全，将会在以后的进样中出现鬼峰，而且是保留时间 不定，会影响定量。
方法总结
❖优点
▪ 灵敏度较高、定量下限较低、操作简单、成本低 ▪ 应用范围较宽，包含常用的四大类15种常用农药，有
GCMS方法检测全血中15种 农药残留
主要内容
1
研究背景
2
应用范围
3
材料与方法
4
实验结果
35
结果讨论与分析
研究背景
▪ 大量研究表明，农药在大量使用后会在环境中存在一定的残留， 农药的化学性质和使用量不同，残留的量也不同。在国内外研究 中，关于农药在生物样本中的残留主要集中在有机氯、有机磷、 拟除虫菊酯类和除草剂四大类。
❖ 根据相关文献和本次实验验证结果，采用低温冷冻的方法 ，可以有效破除乳化现象，提高离心后提取溶剂的回收量 ，从而可以有效提高回收率。
❖ 通过多次实验结果认为，在温度低于20℃持续冷冻大于 20min时，溶剂回收效果较好。在本次实验中加入6ml提 取溶剂回收量≥5ml。因此也提高了目标化合物的回收率 。
选择离子参数
定量离子 173 176 375 241 241 181 181 181
定性离子
173 、127 176 、160 375 、373 241 、265 241 、265 181 、166 181 、265 181 、208
实验结果
1
方法的 线性关系、 检出限、 定量下限
2
方法的 准确度、 精密度
保持0.00min） 10℃/min 280℃（保持4.00min） 20℃/min 320℃（保持6.00min）共23min。 ❖ 进样量：1μl； ❖ 进样方式：脉冲不分流进样 / 不分流进样；
质谱条件
❖ 电离电压：70eV； ❖ 溶剂延迟：6.5min； ❖ 离子源温度：230℃； ❖ 四极杆温度：150℃；
▪ 甲醇、二氯甲烷 ▪ 15种农药标准品（甲拌磷、二嗪农、阿特拉津、
乐果、2,4-D丁酯、扑草净、马拉硫磷、甲基对 硫磷、丁草胺、氯丹、α-硫丹、β-硫丹、联苯菊 酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯） ▪ 保护剂古洛糖酸内酯（sigma试剂公司99.75%）
仪器
▪ Angilent 6890-5973气相色谱-质谱联用仪 ▪ 色谱柱 DB-35MS（30m×0.25mm×0.25μm） ▪ 浓缩仪（氮气吹干） ▪ 涡旋振荡器（转速可调节） ▪ 超声仪 ▪ 离心机
化合物名称 第一水平
甲拌磷
10
二嗪农
10
阿特拉津
10
2,4-D丁酯
10
甲基对硫磷
10
氯丹
10
甲氰菊酯
10
三氟氯氰菊酯 10
第二水平 20 20 20 20 20 20 20 20
第三水平 50 50 50 50 50 50 50 50
第四水平 第五水平
100
200
100
200
100
200
100
200
保护剂使用量的确定
超声提取方法的确定
❖ 在采用液液提取时，加入有机溶剂后，在涡旋混匀过程 中会发生严重的乳化现象，涡旋振荡提取回收率普遍较 低，溶剂回收体积也只能达到加入量的1/2，通过实验发 现，涡旋震荡发生乳化后，再采用超声辅助提取可以明 显提高回收率，但仍无法达到检测要求，主要是溶剂回 收率低的问题仍然没有改善。
色谱、质谱条件
色T谱ex柱t 载气
进样口温度 进样量
进样方式 色谱程序
仪器检测方法 色谱、质谱条件
电离Te电t 压 溶剂延迟 离子源温度 四级杆温度 扫描模式
色谱条件
❖ 色谱柱：DB-35MS（30m×0.25mm×0.25μm）； ❖ 载气：高纯氦气，流速1ml/min； ❖ 进样口温度：280℃； ❖ 色谱程序：120℃（保持1.00min） 20℃/min 240℃（
色谱柱的选择
❖ 根据大多文献农药检测大多使用HP-5或DB-5的毛细管 柱，但本次实验欲测定的化合物机极性范围较宽，而且 其中含有极性较大、检测过程中较不稳定的有机磷类农 药，在检测过程中这些化合物会有轻度拖尾现象。
❖ 另外，样品中还含有大量的脂肪酸、油酸、胆固醇等非 极性化合物，采用非极性柱或是极性较大的毛细管柱， 分离效果都不理想。
❖ 放入清洗超声仪中超声辅助提取20min。
样品预处理（2）
❖ 冷冻破乳、离心分层
❖ 将超声后的试管放入-20℃以下的冰箱中冷冻20-30min 。
❖ 冷冻后取出放置至完全融化后，用高速离心机以 3000rpm离心15min，至完全分为三层。
❖ 将上层液体倒入废液池内，用一只未使用过的空白吸管 将中间层固体（沉淀蛋白）轻轻挤压到试管一侧，然后 将下层提取液全部转移至另一支洁净普通玻璃试管中。
综合考虑
液液提取
固相萃取
提取方法的确定
❖ 固相萃取
❖ Agilent C18： 2,4-D丁酯和联苯菊酯回收率较低 ❖ Oasis HLB C18固相萃取小柱 ❖ 氨基柱 ❖ 苯基柱 ❖ 氧化铝柱
提取方法的确定
❖ 液液提取
❖ 正己烷 ❖ 乙酸乙酯 ❖ 正己烷-乙酸乙酯 ❖ 正己烷-乙腈 ❖ 二氯甲烷：提取回收率效果较好，且只需要一次提取，
化合物名称
甲拌磷 二嗪农 阿特拉津 乐果 2,4-D丁酯 扑草净 甲基对硫磷
选择离子参数
定量离子 260 179 200 125 276 241 109
定性离子
260、231 179、304 200 、215 125 、229 276 、162 241 、184 109 、125
化合物名称
马拉硫磷 丁草胺 氯丹 α-硫丹 β-硫丹 联苯100
200
100
200
100
200
样品预 处理 方法
涡旋震荡、超声提取 冷冻破乳、离心分层 氮吹浓缩、微量定容 移除浓缩液，供仪器检测
样品预处理（1）
❖ 涡旋震荡、超声提取
❖ 将加有1.5ml全血的螺口具塞15ml试管中，缓慢加入6ml 二氯甲烷。
❖ 在涡旋振荡器上涡旋振荡5min（即使发生乳化现象，仍 要继续震荡），转速以液面不接触到试管塞为准。
利于中毒化合物的定性 ▪ 适用于低剂量中毒或是慢性中毒的预防和筛检 ▪ 作为国家科技支撑计划课题(2006BAI06B02)的一部
分，为下一步建立常用农药人群残留量的参比值和全 国范围的具有代表性的生物样品库提供技术支持和可 靠数据。
❖缺点
方法总结
▪ 样品中存在的大量类脂、胆固醇、胆淄二烯等物质没 有有效去除，对仪器污染较大，处理大量样品时，最 好加入气体反吹装置。
❖ 要注意的是，在采取超声措施时，提取容器要使用具塞 玻璃试管，最好是螺口耐有机溶剂的玻璃试管，因为玻 璃试管可以有效传递超声能量，而且在超声过程中，产 生的热量会导致容积蒸汽压增大，以至会冲出普通试管 塞。
冷冻破乳方法的应用
❖ 在采用溶剂液液提取过程中，由于乳化现象的产生，会影 响溶剂的回收量，例如加入6ml有机溶剂，高速离心后只 能取出3ml，甚至更少。这会直接影响目标化合物的提取 效率。
离子选择扫描模式图谱
结果讨论与分析
样品提取净化 条件的优化
保护剂的应用 仪器条件的优化
提取方法的确定 超声提取方法的确定 冷冻破乳方法的应用 确定提取溶剂体积
保护剂的效果评价及 用量的确定
色谱柱的选择
进样方法的选择
定量定性离子的选 择和分组分段扫描
模 式的确定
运行时间的确定
结果讨论与分析
提取方法的确定
应用范围
▪ 人血液中15种常用农药的样品提取方法和GC/MS定性、定 量检测方法。
▪ 有机磷农药
• 甲拌磷、二嗪农、阿特拉津、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷
▪ 有机氯农药
• 氯丹、a-硫丹、b-硫丹
▪ 拟除虫菊酯类农药
• 联苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯
▪ 除草剂
• 2,4-D丁酯、扑草净、丁草胺
试剂