一种脓毒症复合动物模型的构建方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010628481.6
(22)申请日 2020.07.01
(71)申请人 中国科学院上海药物研究所
地址 201203 上海市浦东新区祖冲之路555
号
申请人 天津红日药业股份有限公司
(72)发明人 李川　程晨　杜飞飞　徐方　
王凤清　余玄　董凯　张桂萍　
姚小青　
(74)专利代理机构 上海光华专利事务所(普通
合伙) 31219
代理人 许亦琳　余明伟
(51)Int.Cl.
A61D 1/00(2006.01)
(54)发明名称
一种脓毒症复合动物模型的构建方法
(57)摘要
本发明涉及基础科研用动物模型领域，
特别是涉及一种脓毒症复合动物模型的构建方法，所
述构建方法包括股动脉插管和盲肠结扎穿刺。

本
发明首次将股动脉插管与盲肠结扎穿刺相结合
构建脓毒症复合动物模型，并成功应用于抗脓毒
症药物在模型大鼠上的药代动力学研究，可实现
在同一大鼠上连续血样采集且不影响整体动物
的死亡率，大大节省实验动物数量。

同时可获取
可靠的模型动物药动学数据，对开展相关领域的
药物研究具有重要的借鉴意义。

权利要求书1页 说明书7页 附图5页CN 111920541 A 2020.11.13
C N 111920541
A
1.一种脓毒症复合动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括股动脉插管和盲肠结扎穿刺。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述股动脉插管包括以下步骤：
1)沿腹股沟平行方向开0.5～1.5cm的切口，暴露股动脉；
2)夹住股动脉近心端，在股动脉远心端上开口；
3)将插管头端从开口朝股动脉近心端方向插入，边插边松开股动脉近心端，继续插入3～4cm后结扎固定插管，密封插管；
4)将插管尾端经动物尾部皮下穿刺引出体外，固定在尾部，缝合伤口。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中使用肝素生理盐水密封插管。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述盲肠结扎穿刺包括以下步骤：
1)沿腹正中线做纵行切口，游离盲肠；
2)于盲肠顶端至回盲瓣下方的30％～50％处结扎；
3)穿刺盲肠形成肠瘘，在穿孔周围挤出粪便；
4)将盲肠还纳腹腔，缝合切口。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中穿刺部位选自结扎处至盲肠根部的位置。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在股动脉插管成功后再进行盲肠结扎穿刺。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述脓毒症动物模型选自脓毒症大鼠模型。

8.一种脓毒症复合动物模型，其特征在于，所述脓毒症复合动物模型通过权利要求1-7任一所述的构建方法构建获得。

9.权利要求8所述的脓毒症复合动物模型在脓毒症治疗药物研发中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述用途包括在脓毒症治疗药物的药代动力学研究中的用途。

权　利　要　求　书1/1页CN 111920541 A
一种脓毒症复合动物模型的构建方法
技术领域
[0001]本发明涉及基础科研用动物模型领域，特别是涉及一种脓毒症复合动物模型的构建方法。

背景技术
[0002]脓毒症是由感染引起的全身宿主反应所致器官功能障碍综合征，病情凶险且病死率高(25-50％)，预后不良，成为现代危重病医学面临的难点。

脓毒症(包括脓毒性休克)的常规治疗主要依靠及时合理的抗生素抗感染治疗和调控患者异常反应，但目前针对后者仍缺乏有效治疗的化药，新药研发仍在途中。

中药注射液血必净是目前国内唯一批准用于脓毒症治疗的中药二类新药(2004年)，每年中国约60万脓毒症患者使用血必净，临床实验表明血必净能有效降低脓毒症患者28天死亡率。

各种脓毒症动物模型被广泛用于不同目的的科研实验中。

其中，盲肠结扎穿刺(Cecum Ligation and Puncture,CLP)模型与临床脓毒症有较高的相似性，能较好模拟脓毒症的病理过程，被认为是研究脓毒症的金标准。

虽然CLP 模型发展已非常成熟，但是模型构建难度较大，死亡率不易稳定。

[0003]临床前药代动力学研究在新药的研发过程中相当重要，用于揭示药物在动物体内的动态变化过程，阐明药物吸收、分布、代谢、排泄等过程的动力学特征，并根据数学模型提供重要的动力学参数，参与先导化合物的初步筛选，初步判断药物是否具有进一步开发研究的价值。

对于中成药的上市后再评价，药代动力学也起着十分重要的角色，有助于揭示中药药效物质基础，为中成药大品种的二次开发提供科学数据。

[0004]啮齿类动物大鼠常被用作实验室药代研究的动物，大鼠的血样采集有多种方法：眼眶取血速度快，但对大鼠刺激较大，且取血量不易控制。

尾静脉取血留置针头易脱落。

颈总动脉和颈静脉插管取血虽然使用较多，但是插管位置离主要脏器距离近，易引起意外死亡，且很难实现大鼠自由活动状态下的采血。

目前脓毒症药代动力学研究动物血浆样品采集以大鼠眼眶采血为主，且为了保证数据质量，通常一只老鼠只能采集一个时间点的血样，造成实验动物损耗量较大。

[0005]综上所述，在CLP模型上采取常规采血方法开展药代动力学研究损耗的动物数量较大，不仅增加了实验成本，也不利于实验动物的保护及福利。

发明内容
[0006]鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脓毒症复合动物模型的构建方法，用于解决现有技术中的问题。

[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种脓毒症复合动物模型的构建方法，所述构建方法包括股动脉插管和盲肠结扎穿刺。

[0008]优选地，所述股动脉插管包括以下步骤：
[0009]1)沿腹股沟平行方向开0.5～1.5cm的切口，暴露股动脉；
[0010]2)夹住股动脉近心端，在股动脉远心端上开口；
[0011]3)将插管头端从开口朝股动脉近心端方向插入，边插边松开股动脉近心端，继续插入3-4cm后结扎固定插管，密封插管；
[0012]4)将插管尾端经动物尾部皮下穿刺引出体外，固定在尾部，缝合伤口。

[0013]优选地，步骤3)中使用肝素生理盐水密封插管。

[0014]优选地，所述盲肠结扎穿刺包括以下步骤：
[0015]1)沿腹正中线做纵行切口，游离盲肠；
[0016]2)于盲肠顶端至回盲瓣下方的30％-50％处结扎；
[0017]3)穿刺盲肠形成肠瘘，在穿孔周围挤出粪便；
[0018]4)将盲肠还纳腹腔，缝合切口。

[0019]优选地，步骤3)中穿刺部位选自结扎处至盲肠根部的位置。

[0020]优选地，在股动脉插管成功后再进行盲肠结扎穿刺。

[0021]优选地，所述脓毒症动物模型包括脓毒症大鼠模型。

[0022]本发明第二方面提供一种脓毒症复合动物模型，所述脓毒症复合动物模型通过上述构建方法获得。

[0023]本发明第三方面提供所述脓毒症复合动物模型在脓毒症治疗药物研发中的用途。

[0024]具体的，所述用途为脓毒症复合动物模型在脓毒症治疗药物药代动力学研究中的用途。

[0025]如上所述，本发明的脓毒症动物模型的构建方法，具有以下有益效果：
[0026]1)可将复合模型应用于治疗脓毒症药物在模型动物上的血浆药动学研究。

[0027]2)相比传统的单点处死，本申请的复合模型可实现在同一大鼠上连续血样采集且不影响整体动物的死亡率，可大大节省实验动物数量。

[0028]3)可获取可靠的模型动物药动学数据，对开展相关领域的药物研究具有重要的借鉴意义。

附图说明
[0029]图1-1显示为股动脉插管模型中股动脉插管及插管位置。

[0030]图1-2显示为完成股动脉插管的大鼠。

[0031]图2-1显示为FAC合并CLP脓毒症药代大鼠复合模型制备时盲肠结扎图。

[0032]图2-2显示为FAC合并CLP脓毒症药代大鼠复合模型制备时结扎后穿刺图。

[0033]图2-3显示为FAC合并CLP脓毒症药代大鼠复合模型制备时挤出少量粪便图。

[0034]图2-4显示为FAC合并CLP脓毒症药代大鼠复合模型制备时术后缝合图。

[0035]图2-5显示为FAC合并CLP脓毒症药代大鼠复合模型制备时缝合后的大鼠。

[0036]图3显示为本发明的复合模型动物死亡率统计图。

[0037]图4显示为血必净给药后各组大鼠体内暴露物质血浆药物浓度时间曲线图。

具体实施方式
[0038]本发明提供一种脓毒症复合动物模型的构建方法，所述构建方法包括股动脉插管和盲肠结扎穿刺。

[0039]进一步的，所述股动脉插管包括以下步骤：
[0040]1)沿腹股沟平行方向开0.5～1.5cm的切口，暴露股动脉；
[0041]2)夹住股动脉近心端，在股动脉远心端上开口；
[0042]3)将插管头端从开口朝股动脉近心端方向插入，边插边松开股动脉近心端，继续插入3-4cm后结扎固定插管，密封插管；
[0043]4)将插管尾端经动物尾部皮下穿刺引出体外，固定在尾部，缝合伤口。

[0044]在一较佳实施方式中，暴露股动脉后即在股动脉近心端下预先放置一段手术丝线备用，可避免开口后不便拿取手术丝线，造成手术时间延长甚至动物死亡等情形的发生。

[0045]在一较佳实施方式中，步骤2)中在股动脉远心端开斜口，斜口可方便插管的插入。

[0046]具体的，所述插管选自聚氨酯插管。

[0047]较佳的，步骤3)中使用肝素生理盐水密封插管。

肝素具有强大的体内外抗凝作用，具有抗凝、抗血栓、降低血液粘稠度等药理作用。

[0048]较佳的，所述股动脉插管的整个过程在恒温加热垫上进行，手术完成后直至动物完全清醒再将其移至笼中，可保证麻醉后手术中保持体温，避免动物体温过低而死亡。

[0049]进一步的，所述盲肠结扎穿刺包括以下步骤：
[0050]1)沿腹正中线做纵行切口，游离盲肠；
[0051]2)于盲肠顶端至回盲瓣下方的30％-50％处结扎；
[0052]3)穿刺盲肠形成肠瘘，穿孔周围挤出粪便；
[0053]4)将盲肠还纳腹腔，缝合切口；
[0054]具体的，步骤2)中，用4-0或5-0丝线结扎。

[0055]步骤2)中结扎的部位至关重要，结扎部位不同可能会导致模型动物的死亡率不同，同一批实验中应尽量保持结扎部位一致。

[0056]步骤3)中穿刺部位选自盲肠顶端至回盲瓣下方的一段盲肠。

[0057]步骤3)中穿刺时所用的穿刺针型号和穿刺盲肠的次数可根据具体情况决定，针孔越多，针孔越大，可能会导致模型大鼠死亡率越高。

在一种实施方式中，可以用16G穿刺针全层穿透穿刺两次形成肠瘘。

[0058]步骤3)中挤出的粪便量需适量，依目标死亡率而定，因粪便导致腹腔感染是模型大鼠死亡的主要原因。

若目标死亡率在60-70％，则挤出粪便为米粒大小。

[0059]较佳的，盲肠结扎穿刺术后皮下注射生理盐水帮助动物机体恢复正常。

[0060]较佳的，股动脉插管和盲肠结扎穿刺术前均需要用常规的麻醉剂将动物麻醉，麻醉成功后将动物仰卧位固定在手术台上。

然后剃除手术区域的被毛，剃毛前后可用消毒剂擦拭皮肤。

[0061]股动脉插管和盲肠结扎穿刺术后常规饲养，恢复至术前体重后备用。

恢复期间，需要每天检查插管的开放性并使用肝素生理盐水封管，防止堵塞。

[0062]可先进行股动脉插管和盲肠结扎穿刺中的任一实验。

较佳的，在股动脉插管成功后再进行盲肠结扎穿刺，因股动脉插管是微创手术，大鼠恢复至常态后再进行盲肠结扎穿刺手术能更好地保证死亡率的可控性。

[0063]在一较佳实施方式中，在股动脉插管成功24～72h后再进行盲肠结扎穿刺。

适当的间隔时间可保证股动脉插管后动物机体恢复正常。

[0064]所述脓毒症复合动物模型选自脓毒症大鼠模型。

[0065]本发明第二方面提供一种脓毒症复合动物模型，所述脓毒症复合动物模型通过上述构建方法获得。

[0066]本发明第三方面提供所述脓毒症动物模型在脓毒症治疗药物研发中的用途。

[0067]具体的，所述用途为脓毒症动物模型在脓毒症治疗药物药代动力学研究中的用途。

[0068]在一种实施方式中，所述脓毒症治疗药物为血必净。

[0069]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。

本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

[0070]在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

[0071]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。

除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

[0072]实施例1股动脉插管(FAC)模型制备
[0073]大鼠经水合氯醛溶液(50mg/ml)麻醉(8ml/kg)后，使用电动剃毛刀将大鼠大腿(腹侧)、腹股沟及近尾部的被毛剃除，用消毒酒精擦拭被剃部位。

将大鼠仰卧位头部朝前置于恒温(37℃)加热垫上，四肢用医用胶布粘贴固定，手术区域暴露于手术显微镜视野中。

如图1-1所示，沿腹股沟平行方向剪开约1.0cm的切口，钝性分离后暴露股动脉，在动脉血管的近心端下预先放置一段用于结扎的手术丝线(约5cm)。

用动脉夹夹住血管的近心端，用眼科剪在血管远心端上开一斜口，将聚氨酯插管前端从切口沿近心端方向插入，边插边松开动脉夹，动脉血随即冲入插管，继续插入3-4cm后用手术丝线结扎固定，使用肝素生理盐水(25IU)充满插管，密封。

用穿刺针将插管尾端经大鼠尾部皮下穿刺引出体外，通过套管固定在尾部(如图1-2所示)，缝合伤口，酒精消毒。

手术完成后，皮下注射补充无菌生理盐水(s.c.，20ml/kg)，继续放在加热垫上至大鼠完全清醒。

大鼠清醒后按每笼2只合并饲养，恢复至术前体重后备用。

恢复期间，每天检查插管的开放性并使用肝素生理盐水封管，防止堵塞。

[0074]实施例2股动脉插管(FAC)合并盲肠结扎穿刺(CLP)脓毒症药代大鼠复合模型制备[0075]股动脉插管大鼠制备成功后48小时，采用盲肠结扎穿刺(CLP)法制备脓毒症模型，手术方法采用改进的CLP操作。

麻醉成功后将大鼠仰卧位固定在手术台上，用安尔碘涂搽腹部手术区域皮肤2遍后用刀片将腹部的毛刮除干净；沿腹正中线做约2cm的纵行切口，逐层分离皮肤和肌层，游离盲肠，于盲肠顶端至回盲瓣下方的30-50％处用4.0丝线结扎(图2-1)；并用16G穿刺针穿刺盲肠2次形成肠瘘(图2-2)，穿孔周围挤出少量粪便(图2-3)。

将盲肠
还纳腹腔，逐层缝合切口(图2-4和图2-5)。

假手术(Sham)即只将大鼠盲肠掏出腹腔再复还纳腹腔后将腹部缝合即可。

术后皮下注射生理盐水(20mL/kg)。

术后自由饮水，20–24℃保温，常规饲养。

[0076]实施例3FAC合并CLP复合模型的动物死亡率评价
[0077]28天死亡率为脓毒症临床主要结局指标，动物观察期为7天。

将150只大鼠随机分为Sham组(n＝30)、CLP组(n＝30)、FAC+CLP组(n＝30)、CLP+XBJ组(n＝30)、FAC+CLP+XBJ组(n＝30)，以上各组中XBJ代表血必净。

各组做如下处理：(1)Sham组：手术后2、12、24、36、48、60h经静脉注射生理盐水4mL/kg。

(2)CLP组：CLP手术后2、12、24、36、48、60h经静脉注射生理盐水4mL/kg。

(3)CLP+FAC组：FAC大鼠经CLP手术后2、12、24、36、48、60h经静脉注射生理盐水4mL/kg。

(4)CLP+XBJ组：CLP手术后2、12、24、36、48、60h经静脉注射血必净4mL/kg。

(5)CLP+ FAC+XBJ组：FAC大鼠经CLP手术后2、12、24、36、48、60h经静脉注射血必净4mL/kg。

观察记录各组1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d死亡率。

通过组间病死率的比较，考察FAC对CLP脓毒症大鼠模型死亡率的影响，并在两种模型上比较血必净的治疗作用。

[0078]如图3和表1所示，CLP大鼠和CLP+FAC大鼠的死亡率相近，表明FAC为微创手术，对CLP模型大鼠的死亡率影响甚微，该复合模型构建成功。

此外，血必净对两种模型治疗作用也相近。

[0079]表1各组别大鼠死亡率
[0080]
[0081]实施例4FAC合并CLP复合模型上血必净血浆药动学研究
[0082]将42只大鼠随机分为正常大鼠XBJ组(n＝6)、CLP大鼠XBJ组(n＝30)、CLP+FAC大鼠XBJ组(n＝6)。

各组做如下处理：(1)正常大鼠XBJ组：FAC大鼠经CLP手术后2h经尾静脉注射血必净4mL/kg，在同一只大鼠上经股动脉连续采集给药后10min、30min、1h、3h和6h的血浆样品，平行6只大鼠；(2)CLP大鼠XBJ组：CLP手术后2h经尾静脉注射血必净4mL/kg，分别于给药后10min、30min、1h、3h和6h眼眶采集血浆样品，各时间点各处死6只大鼠；(3)CLP+FAC大鼠XBJ组：FAC大鼠经CLP手术后2h经尾静脉注射血必净4mL/kg，采集方案同(1)，即分别于给药后10min、30min、1h、3h和6h在同一只大鼠上经股动脉连续采集血浆样品，平行6只大鼠。

采集的血浆经样品前处理后用LC-MS/MS分析其中血必净关键物质的浓度。

药动学参数(包括C10min、AUC0-6h、AUC0-∞、t1/2、MRT、CLtotal、VSS)用InnaPhase Kinetica 2000TM软件(version 5.0；Thermo Scientific,Philadelphia,PA,USA)用非房室模型分析处理。

实验数据用均值±标准差(mean±SD)表示。

[0083]结果如表2和图4所示，与正常组比较，CLP+FAC组和CLP组血必净给药后体内暴露物质各药代参数变化趋势是一致的，且CLP+FAC组和CLP组数值很接近。

证明，FAC实现连续血样采集获得的药代数据是准确可靠的，采用FAC+CLP开展药代动力学研究将大大减少动物使用数量。

[0084]表2血必净给药后各组大鼠体内暴露物质的药代参数比较
[0085]
[0087]以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限
制。

此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的
前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。

虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。

事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

图1-1
图1-2
图2-1
图2-2
图2-3
图2-4
图2-5
图3
图4。