伊维菌素纳米乳透皮制剂的研究

伊维菌素纳米乳透皮制剂的研究
丁丹;盛小莉;梁孔贤;许琦;刘卫
【摘要】本试验研制伊维菌素纳米乳透皮制剂,并对其理化性能、稳定性、体外药物释放及透皮性能进行评价.采用三元相图筛选不同载药量的纳米乳,确定最佳载药量;采用响应面优化设计筛选纳米乳处方,考察了伊维菌素纳米乳的平均粒径、电位、形态、pH、黏度等性能;分别采用透析袋法和Franz扩散池法比较伊维菌素纳米乳透皮制剂与市售伊维菌素皮肤涂剂的体外释放行为和透皮性能.结果显示,载药量为2.00％时,纳米乳区域最大、最稳定;获得的优选处方为聚氧乙烯蓖麻油∶二乙二醇
单乙基醚∶油酸乙酯∶伊维菌素∶水=26∶12∶7∶2∶53;所得伊维菌素纳米乳的平均粒径为18 nm;伊维菌素纳米乳在室温条件和4℃冰箱中保存1年仍稳定;其24
h皮肤累积渗透量和滞留量分别是市售伊维菌素皮肤涂剂的3.24和2.05倍.研究
结果表明,研制的新型伊维菌素纳米乳透皮制剂具有制备工艺简便、稳定性好、透
皮性能好等优点,具有很好的应用前景.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)002
【总页数】7页(P401-407)
【关键词】伊维菌素;纳米乳;三元相图;响应面优化设计;体外药物释放;透皮性能【作者】丁丹;盛小莉;梁孔贤;许琦;刘卫
【作者单位】华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074;华中科技大学国家
纳米药物工程技术研究中心,武汉430074;华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074;武汉百思凯瑞纳米科技有限公司,武汉430074;华中科技大学生命科学与
技术学院,武汉430074;华中科技大学国家纳米药物工程技术研究中心,武汉430074;武汉百思凯瑞纳米科技有限公司,武汉430074
【正文语种】中文
【中图分类】S859.7
伊维菌素(ivermectin，IVM)是一种广谱、高效、安全的半合成大环内酯抗生素类驱虫药，被广泛用于驱杀牛、羊、马、猪的胃肠道线虫、肺线虫和寄生节肢动物，犬的肠道线虫、耳蟥、疥螨、心丝虫和微丝蚴及家禽胃肠线虫和体外寄生虫。

但伊维菌素水溶性低，保存稳定性差，其常规透皮制剂的应用受到限制[1]。

纳米乳(nanoemulsion，NE)是由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相自发形成的一种外观澄清透明、均一、热力学稳定的体系，粒径在10～100 nm[2]。

研究结果
表明，纳米乳不仅可以增溶药物而且可以通过改变皮肤角质层的结构来增强药物的透皮吸收[3-4]。

本试验研制新型伊维菌素纳米乳透皮制剂，以改善伊维菌素透皮
吸收和皮肤治疗效果，同时解决其难溶于水、稳定性差的缺点。

1.1 仪器设备
Agilent 1260 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，色谱柱：依利特ODS2 C18
柱250 mm×4.6 mm Hypersil(粒径5 μm)；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度分
析仪(英国Malvern公司)；旋转流变仪(Malvern kinexus)；雷磁PHS-3E pH计；HITACHIH-7000FA型透射电镜(日立公司)；TK-12D型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司)；恒温磁力搅拌器(郑州英峪予华仪器有限公司)；台式高速冷
冻离心机TGL-20M(长沙平凡仪器仪表有限公司)；电子天平(丹佛仪器(北京)有限
公司，Max110 g)。

1.2 试验动物和试剂
Wistar大鼠((300±20)g，雄性，湖北预防医学科学院动物中心)。

伊维菌素原料药
(纯度93.5%，华南农业大学实验兽药厂提供)；伊维菌素标准品(中国药品生物制
品检定所)；市售伊维菌素皮肤涂剂(规格：100 mL∶5 g，广西神龙兽药有限公司)；聚氧乙烯蓖麻油(EL-35，德国BASF)；二乙二醇单乙基醚(Transcutol HP，法国Gattefosse公司)；油酸乙酯(Ethyl Oleate，EO，国药集团CP级)；纤维素半透
膜(相对分子质量3 500，宽度36 mm，BIOSHARP，USA)；无水乙醇(国药集团AR级)；水合氯醛(国药集团AR级)；十二烷基硫酸钠(SDS，国药集团AR级)；甲醇(国药集团色谱级)。

1.3 方法
1.3.1 绘制空白和不同载药比例的三元相图将油、表面活性剂和助表面活性剂作
为三相，准确称取处方量的相应组分，使得其对应坐标在相图中均匀分布[5-6]，30 ℃恒温磁力搅拌混匀后，加入不同比例的药物，继续搅拌，以1∶10比例缓慢滴加水乳化[7]，激光粒度仪测定最终形成体系的粒径大小，看是否在纳米乳区。

利用Origin 8.0画出空白和不同载药比例的三元相图[8]。

1.3.2 响应面优化设计优选处方根据Central Composite试验设计原理[9-10]，
确定EL-35、Transcutol HP、EO这3个对伊维菌素纳米乳形成影响较大的因素，3种辅料的比例范围分别为20.00%～35.00%、10.00%～15.00%、5.00%～
15.00%，伊维菌素为2.00%，其余均为水。

以粒径为响应值，利用Design Expert 8.0.6设计响应面分析试验。

响应面试验设计见表1。

1.3.3 伊维菌素纳米乳理化性能取适量伊维菌素纳米乳，测定pH，并用旋转流变仪测定其黏度，超纯水稀释后，激光粒度仪测定其粒径和电位，并取一滴加在碳膜铜网上，自然晾干，2%磷钨酸负染1 min，晾干，透射电镜观察其形态和大小。

1.3.4 离心和放置稳定性评价将伊维菌素纳米乳透皮制剂12 000 r/min离心15 min，并于室温和4 ℃放置1年后观察是否分层。

1.3.5 HPLC含量测定方法的建立色谱条件：流动相：甲醇∶水=90∶10，流速：
1.0 mL/min，紫外检测波长：245 nm，柱温：30 ℃，进样量：20 μL。

标准曲
线绘制：精密称取55.5 mg 伊维菌素标准品，加入适量甲醇溶解，待伊维菌素完
全溶解后，倒入50 mL容量瓶中定容，配制成111.0 μg/mL储备液。

精密吸取适量储备液，分别配制成2.22、6.66、11.1、33.3、66.6、111.0 μg/mL的标准溶液。

精密度试验：取浓度为111.0 μg/mL标准溶液日内重复进样5次，连续测定
5 d；溶液稳定性试验：取浓度为111.0 μg/mL的标准溶液，避光保存，于0、2、4、6、8、12 h后进样20 μL，考察峰面积的变化；回收率试验：取储备液3.0、6.0、8.0 mL各3份分别置于9个10 mL容量瓶中，配制成低、中、高3个不同
浓度的标准溶液，加入处方量的空白纳米乳后，用甲醇定容，超声20 min破乳[11-12]，0.45 μm有机滤膜过滤后，进样测定，计算回收率。

1.3.6 体外释放研究选用纤维素半透膜为渗透膜，于使用前在超纯水中煮沸20 min。

分别取2 g伊维菌素纳米乳透皮制剂和市售伊维菌素皮肤涂剂加入透析袋中，用绳子扎紧两端，将透析袋置于装有50 mL 2% SDS-20%乙醇—生理盐水释放介质的锥形瓶中，(37±0.5)℃摇床振摇，速度为300 r/min，于1、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120 h取样1 mL，再迅速补充1 mL相同温度的空白释
放介质[13]。

样品用0.45 μm有机滤膜过滤后，进样测定，计算药物不同时间的
累积释放度。

1.3.7 体外透皮研究获取离体鼠皮：取健康Wistar大鼠，10%水合氯醛麻醉(每100 g Wistar大鼠注射0.4 mL)后，用电动理发剪剃去腹部鼠毛，涂上脱毛膏，
脱脂棉轻轻擦去脱下的鼠毛，超纯水清洗干净，饲养1 d后断颈处死，取下腹部
皮肤，轻轻刮去脂肪组织和结缔组织，浸泡于生理盐水中，并放入4 ℃冰箱中保
存备用，1周内使用完毕[14]。

体外透皮试验：采用改进的垂直式Franz扩散池法进行体外透皮试验。

将皮肤固定于供给室和接收室之间，皮肤角质层面向供给室，用铁夹夹紧。

精密称取1.0 g伊维菌素纳米乳透皮制剂及市售伊维菌素皮肤涂剂，
置于扩散池的供给室，以含2% SDS-20%乙醇—生理盐水的溶液为接受介质，加
入8 mL于接收室中，排出气泡，使皮肤和接收液面完全接触，接收液以300
r/min的速度磁力搅拌。

分别于2、4、6、8、10、12、24 h将接收池中的接收
介质取出0.5 mL，同时迅速补以相同体积相同温度的空白接收介质。

将取得的样
品经0.45 μm有机滤膜过滤，采用HPLC法测定不同时间点接收介质中伊维菌素
的浓度，按公式计算药物不同时间的累积渗透量其中，Cn、Ci为第n个和第i个
取样点测得的药物浓度；V0为扩散池体积；Vi为每次取样的体积。

单位面积累积渗透量 Q=Qn/S ，其中S为扩散池的面积3.14 cm2。

透皮试验结束后，取下鼠皮，用生理盐水彻底清洗皮肤后用滤纸吸干皮肤表面水分，用剪刀将皮肤剪成小块，研钵充分研磨皮肤至乳糜状，加入1 mL乙醇萃取伊维菌素，全部转移至离心管，再用9 mL乙醇溶液清洗研钵数次，全部转移至离心管，5 000 r/min离心15
min[15]，取上清液经0.45 μm有机滤膜过滤后，HPLC进样测定。

2.1 不同载药量三元相图的比较
不同载药量三元相图的比较结果见图1。

由图1可知，载药体系与空白体系相比纳米乳区域变大，且随着载药量的增加，纳米乳区有渐增趋势，但载药2.5%时有较多处方出现药物析出，所以选择纳米乳区大、稳定性好的2%为最佳载药量。

2.2 响应面优化设计筛选处方
响应面试验结果见表2，因素交互作用见图2。

由方差分析可知，EL-35和EO的
比例对纳米乳形成有较大影响。

优选处方：EL-35 26.00%，Transcutol HP
12.00%，EO 7.00%，伊维菌素2.00%，水53.00%。

2.3 伊维菌素纳米乳理化性能
伊维菌素纳米乳粒径及其分布、外观形态分别见图3和4。

激光粒度仪测得伊维菌素纳米乳粒径为18 nm，多分散指数(PDI)为0.034；TEM表征结果表明，伊维菌素纳米乳近似球形，粒径与激光粒度仪测得粒径接近；测得伊维菌素纳米乳Zeta
电位为-2.54 mV，pH为4.35，黏度为0.15 Pa·s；稳定性评价结果表明，其离心和放置后仍澄清透明，均未见分层，粒径及其分布也基本无变化，表明稳定性良好。

2.4 HPLC方法学建立
以峰面积为横坐标(X)，以药物浓度为纵坐标(Y)得到回归方程：
Y=0.0238X+0.9774，R2=0.9990，结果表明，伊维菌素浓度在2.22～111.0
μg/mL范围内呈良好的线性关系。

日内RSD=0.72%，日间RSD=0.96%，12 h
内溶液稳定性RSD=0.27%，平均回收率为102.18%。

伊维菌素原料药和标准品
保留时间相一致，约9 min(图5)，处方中的辅料在245 nm处无吸收，所以不干扰伊维菌素的含量测定。

2.5 体外释放评价
伊维菌素纳米乳透皮制剂和市售伊维菌素皮肤涂剂体外释放结果见图6。

由图6可知，伊维菌素纳米乳透皮制剂和市售伊维菌素皮肤涂剂120 h释放度分别为
19.63%和2.89%，前者明显高于后者。

2.6 体外透皮试验
体外透皮试验结果见图7和8。

伊维菌素纳米乳透皮制剂24 h单位面积皮肤累积
药物渗透量为1 813.96 μg，是市售伊维菌素皮肤涂剂的3.24倍；伊维菌素纳米
乳透皮制剂24 h单位面积皮肤药物滞留量为57.62 μg，是市售伊维菌素皮肤涂剂的2.05倍。

伊维菌素是水难溶性药物，且生物利用度较低，将其制备成O/W型纳米乳后，不仅达到了增溶药物的目的，纳米乳的促渗作用又增加了伊维菌素的透皮性能。

而且试验证明，本研究制备的伊维菌素O/W型纳米乳可以用水进行稀释而不会破坏其结构。

纳米乳区域的大小可以反映出体系形成纳米乳能力的强弱。

本研究采用三元相图，以纳米乳区大小和稳定性为考察指标，通过与其他非离子型表面活性剂(吐温-80、
聚氧乙烯氢化蓖麻油RH-40)、助表面活性剂(1，2-丙二醇)和油相(油酸)比较之后，最终确定纳米乳区域大、稳定性好的EL-35/Transcutol HP/EO作为载药体系。

在伊维菌素纳米乳制备过程中发现，温度、搅拌速度和时间对其形成的影响不明显，而表面活性剂、助表面活性剂和油相的比例则对其形成起着关键作用。

采用响应面优化软件设计出20个不同比例的处方，以粒径为响应值，筛选最优处方。

由方差分析可知，Model的F值为6.75，P值为0.0042，说明构建的模型差异性显著，只有0.42%的可能，这种显著性是来自于外界条件干扰。

P值小于0.05说明这项
对结果影响显著，大于0.10说明为不显著影响，因此EL-35、EO是伊维菌素纳
米乳形成的显著影响因素。

失拟项的F值为2.41，P值为0.1808，说明失拟项不显著，拟合度高。

体外释放试验时，因为伊维菌素的水溶性较差，所以在释放介质中加入表面活性剂SDS和乙醇增溶药物，以保证达到漏槽条件。

而且SDS和乙醇在245 nm处无紫外吸收，所以不会干扰伊维菌素的检测。

由伊维菌素体外释放曲线可知，在前10 h，伊维菌素纳米乳透皮制剂和市售伊维菌素皮肤涂剂的释放度差别不大，而10 h 以后，市售伊维菌素皮肤涂剂释放较缓慢，逐渐趋于平缓，而伊维菌素纳米乳透皮制剂释放度增大仍较明显，这对于伊维菌素长时间发挥驱虫作用、减少给药次数具有重要意义。

Franz扩散池法是体外透皮试验中常用的方法。

由伊维菌素皮肤累积渗透量曲线可知，在6 h之前，伊维菌素纳米乳透皮制剂和市售伊维菌素皮肤涂剂的累积渗透量较接近；6 h之后，伊维菌素纳米乳透皮制剂的药物累积渗透量明显高于市售伊维菌素皮肤涂剂，且随着时间的延长，差距逐渐增大。

说明伊维菌素纳米乳透皮制剂的透皮性能优于市售伊维菌素皮肤涂剂。

体外释放试验时，24 h伊维菌素纳米乳释透皮制剂药总量仅为1 140.0 μg，但体外透皮试验时伊维菌素渗透量却达到5 695.8 μg，在相同时间的情况下，伊维菌
素纳米乳透皮制剂体外透皮量远高于体外释药试验时的释放量。

这可能与伊维菌素的脂溶性有关，因为其难溶于水，虽然体外释放试验时在释放介质中加入了SDS
和乙醇增溶，但是溶解度仍然不高，所以体外释放度较低。

而在透皮试验中，伊维菌素可与皮肤中脂溶性成分发挥相互作用而促进药物从微乳中释放出来，并且许多研究表明纳米乳能显著促进药物的透皮吸收[16-17]，所有这些特性使得伊维菌素纳米乳制剂具有较高的皮肤渗透量和皮肤滞留量，从而更好地发挥体内外的驱虫作用。

本试验研制了由EL-35/Transcutol HP/EO/H2O体系组成的伊维菌素O/W型纳米乳透皮制剂，其稳定性好，透皮性能优异，且制备工艺简便，易于大规模生产。

*通信作者：刘卫，男，教授，博士生导师，主要从事纳米载药系统、现代制剂技术等研究，Tel：************/68789309；E-mail：*************.cn
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