固相析出分

第一节 盐析法

（4）盐析后一般须放置0.5-1小时，待沉淀完全后才 过滤离心，过早的分离将影响收率，低浓度的硫酸铵 溶液盐析后固液分离采用离心方法，高浓度硫酸铵溶 液则常用过滤方法。因高浓度硫酸铵的密度太大，蛋 白质要在悬浮液中沉降出来，需要较高离心速度和长 时间的离心操作，故采用过滤法较合适。 （5）盐析过程中，搅拌必须是有规则的和温和的。 搅拌太快将引起蛋白质的变性，其变性特征是起泡。
第二节 有机溶剂沉淀法



4、中性盐浓度 较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质 变性。一般在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.01～ 0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、 氯化钠等。 5、某些金属离子 一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些呈阴离子状 态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低 而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用 量。 使用时要避免与这些金属离子形成难溶盐的阴离 子存在（如硫酸根）。实际操作时常先加有机溶剂除 去杂蛋白，再加Ca2+、Zn2+沉淀目的物。
第一节 盐析法
种方法： （1）在一定的pH和温度下，改变盐浓度（即离子强 度）达到沉淀的目的； （2）在一定的盐浓度（离子强度）下，改变溶液的 pH和温度，达到沉淀的目的。 在多数情况下，尤其是生产中，常用第一种方法，使 目的物或杂蛋白析出。这样做使得被盐析物质的溶解 度剧烈下降，容易产生共沉现象，但分辨率不高，所 以第一种方法多用于提取液的前期分离工作（蛋白质 的粗提）。在分离的后期阶段（即蛋白质的进一步分 离纯化时）常用第二种方法，因为第二种方法被盐析 物质的溶解度变化缓慢且变化幅度小，分辨率较高。
第一节 盐析法


一、盐析法的原理及特点 1、盐析法的原理 1）中性盐离子中和蛋白质表面电荷。高浓度的中性 盐溶液中存在大量的带电荷的盐离子，他们能中和蛋 白质分子的表面电荷，使蛋白质分子间的静电排斥作 用减弱甚至消失而能相互靠拢，聚集起来。 2）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜。中性盐的亲水 性比蛋白质大，他会抢夺本来与蛋白质结合的自由水， 使蛋白质表面的水化层被破坏，导致蛋白质分子间的 相互作用增大而发生凝聚，从而沉淀析出。


2、加硫酸铵的操作方法 （1）加硫酸铵的饱和溶液。（在实验室和小规模生 产中溶剂体积不大时，或硫酸铵浓度不需要太高时， 可采用这种方式。他可以防止溶液局部过浓，但加量 过多时，料液会被稀释，不利于下一步的分离纯化。） 为达到一定的饱和度，所需加入的饱和硫酸铵溶液的 体积可由下式求得
S 2 S1 V V0 1 S2
第二节 有机溶剂沉淀法


优点：分辨率高于盐析；乙醇等有机溶剂沸点 低，易挥发除去，不会残留于成品中，产品更 纯净；沉淀物与母液间的密度差较大，分离容 易。 缺点：有机溶剂沉淀法易使蛋白质等生物大分 子变性，操作需在低温下进行；需要耗用大量 有机溶剂，成本较高，有机溶剂一般易燃易爆， 所以贮存比较困难或麻烦。
第一节 盐析法


2、盐析法的特点 优点： 经济、安全、操作简便、不需特殊设 备、应用范围广泛、不易引起蛋白质变性 。 缺点：盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗 提纯阶段，需和其它方法交替使用。
第一节 盐析法





二、盐析用盐的选择 选用盐析用盐主要考虑以下几个问题： 1、盐析作用强。一般来说多价阴离子的盐析作用强。 2、盐析用盐必须要有足够大的溶解度，且溶解度受 温度的影响应尽可能地小。这样便于获得高浓度盐溶 液，有利于操作，尤其是在较低温度下操作，不致造 成盐结晶析出，影响盐析结果； 3、盐析用盐在生物学上是惰性的，不致影响蛋白质 等生物大分子的活性。最好不引入给分离或测定带来 麻烦的杂质； 4、来源丰富、经济。


（6）为了平衡硫酸铵溶解时发生的轻微酸化作用， 沉淀反映至少应在50mmol/L缓冲溶液中进行。
第二节 有机溶剂沉淀法



向蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量 亲水性的有机溶剂（丙酮或乙醇），能显著降 低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析 出。 不同的蛋白质沉淀时所需的有机溶剂的浓度不 同，因此，调节有机溶剂的浓度，可以使混合 蛋白质溶液中的蛋白质分段析出，达到分离纯 化的目的。 有机溶剂沉淀法不仅适用于蛋白质的分离纯化， 还常用于酶、核酸、多糖等物质的分离纯化。
第四章 固相析出分离技术
刘耀玺 河南科技大学林业职业学院生物技术教研室
概

述
概念： 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生 化产物以固体形式从溶液中沉降析出的分离纯化 技术，称为固相析出技术。 固相析出技术由于设备简单、操作方便、成本低， 所以广泛应用于生物产品的下游加工过程。 固体有晶体（结晶）和无定形两种形态，所以， 在固相析出过程中，析出物为晶体时，称为结晶 法；析出物为无定形固体时称为沉淀法。 常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶剂沉淀法和 等电点沉淀法等
第二节 有机溶剂沉淀法


一、有机溶剂沉淀法的原理和特点 1、原理 有机溶剂沉淀的机理主要有两点： 1）加入有机溶剂后，会使水溶液的介电常数 降低，而使溶质分子之间的静电引力增加，从 而促使他们互相聚集，并沉淀出来。 2）破坏蛋白质表面的水膜。水溶性有机溶剂 的亲水性很强，它会抢夺本来与亲水溶质结合 的自由水，使其表面的水化层破坏，导致溶质 分子之间的互相作用增大而产生凝聚，从而沉 淀析出。
第一节 盐析法




常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、磷 酸钠、磷酸钾等。 硫酸铵具有盐析作用强，溶解度大且受温度影响小， 一般不会使蛋白质变性，价廉易得，分段分离效果较 好等优点，所以大多数情况下都采用硫酸铵进行盐析。 但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的pH值在 4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水调整到pH7左右。 硫酸钠虽无腐蚀性，但低于40℃就不容易溶解，因 此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程，应用 远不如硫酸铵广泛。 磷酸盐也常用于盐析，具有缓冲能力强的优点，但他 们的价格较昂贵，溶解度较低，还容易与某些金属离 子生成沉淀，所以应用都不如硫酸铵广泛。



第一节 盐析法



盐析的概念: 在高浓度中性盐存在的情况下， 蛋白质（或酶）等生物大分子在水溶液中的溶 解度降低并沉淀析出的现象，称为盐析。 不同的蛋白质盐析时所需的盐的浓度不同，因 此，调节盐的浓度，可以使混合蛋白质溶液中 的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。 不仅蛋白质，许多生化物质都可以用盐析法进 行沉淀分离，如多肽、多糖、核酸等。
第二节 有机溶剂沉淀法

三、有机溶剂的用量计算 进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液达到一定的溶剂浓 度，需加入有机溶剂的量可参考表（专用的制备较低 浓度乙醇1L所需较高浓度乙醇及水的用量表）或按下 面的公式计算：
S 2 S1 V V0 100 % S 2

式中，V—需加入的有机溶剂的体积； V0—原溶液体积；S1—原溶液中有机溶剂的浓度； S2—需达到的有机溶剂的浓度； 100%—是指加入的有机溶剂浓度为100%，如果不是 100%，则以实际纯度带入计算。
第一节 盐析法




三、影响盐析的因素 1、盐饱和度的影响 不同的蛋白质，其结构和性质 不同，盐析时所需的饱和度也就不同。 2、蛋白质浓度的影响 在相同的盐析条件下，蛋白 质浓度越大越易沉淀，但蛋白质的浓度愈高，其它蛋 白质的共沉作用也愈强，从而使分辨率降低，一般常 将蛋白质浓度控制在2～3％为宜。 3、pH的影响 进行盐析时的pH，要选择在被盐析的 蛋白质的等电点（pI）附近。 4、 温度的影响 在高盐浓度下，它们的溶解度随温 度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质变性。 蛋白质的盐析一般在室温下进行。
第二节 有机溶剂沉淀法





二、常用的有机溶剂 常用于生物大分子沉淀的有机溶剂有乙醇、丙酮和甲醇 等。 乙醇是最常用的沉淀剂，因为它具有沉淀作用强、沸点 适中、无毒等优点，广泛用于沉淀蛋白质、核酸、多糖 等生物大分子及核苷酸、氨基酸等。 丙酮的介电常数小于乙醇，故沉淀能力较强，用丙酮代 替乙醇作沉淀剂一般可较少用量1/4-1/3，但其具有沸点 较低、挥发损失大、对肝脏有一定的毒性、着火点低等 缺点，使他的应用不及乙醇。 甲醇的沉淀作用和乙醇相当，对蛋白质的变性作用比乙 醇、丙酮都小，但由于甲醇口服有剧毒，所以应用也不 及乙醇。
第二节 有机溶剂沉淀法



具体操作时可以采用以下方法： ①将待分离的溶液和有机溶剂分别进行预冷， 后者最好预冷至-20至-10 ℃。 ②为了避免温度骤然升高损失蛋白质的活力， 操作时还应不断搅拌、少量多次加入。 ③为了较少有机溶剂对蛋白质的变性作用，通 常使沉淀在低温下短时间（0.5-2h）处理后即 进行过滤或离心分离，接着真空抽去剩余溶剂 或将沉淀溶入大量缓冲溶液中，以稀释有机溶 剂，目的是减少有机溶剂与目的物的接触。
第一节 盐析法



（2）直接加固体硫酸铵。在工业生产中，溶液体积 较大时，或硫酸铵浓度需要达到较高饱和度时，可采 用这种方式。但加入的速度不能太快，应分批加入， 并充分搅拌，使其完全溶解，注意防止局部过浓。 为达到所需的饱和度，应加入固体硫酸铵的量，可由 表查得，或由下式计算而得 G ( S 2 S1 ) X 1 AS 2 式中: S1及S2—初始和最终溶液的饱和度，％； X—1L溶液所需加入得固体硫酸铵的克数； G—经验常数，0℃时为515；20℃为513； A—常数，0℃时为0.27；20℃为0.29。
第一节 盐析法




四、盐析操作（以硫酸铵为例） 1、盐析用盐量的确定（盐析曲线的制作） 盐析分离一个蛋白质料液所需的最佳硫酸铵浓 度或饱和度，可以通过实验确定。实验步骤见 P46 从盐析曲线可以确定沉淀分级操作应选择的饱 和度范围，具体的饱和度值应根据同时得到较 大的纯化倍数和回收率而定。
第一节 盐析法
第一节 盐析法




3、操作注意事项 （1）加固体硫酸铵时，必须看清楚“硫酸铵添加 量”表上所规定的温度，一般有室温和0℃两种， 加入固体盐后所引起的体积变化已考虑在表中， 不必再考虑。 （2）分段盐析时，要考虑到每次分段后蛋白质浓 度的变化。蛋白质浓度不同，要求盐析的饱和度 也不同。 （3）为了获得试验的重复性，盐析的条件（如 pH、温度和硫酸铵的纯度）都必须严格控制。

式中V－加入的饱和硫酸铵溶液的体积，L； V0—溶液的原始体积，L； S1及S2—初始和最终溶液的饱和度，％。
第一节 盐析法

饱和硫酸铵溶液配置应达到真正饱和，配置时 加入过量的硫酸铵，加热至50-60℃，保温数 分钟，趁热滤去不溶物，在0-25℃下平衡1-2 天，有固体析出，即达到100%饱和。
第二节 有机溶剂沉淀法


上式和盐析公式一样未考虑混合后体积的变化，实际 上等体积的乙醇和水相混合后体积会缩小5%，如此 的体积变化对大多数工作影响不大，在有精确要求的 场合可按物质的量比计算，这样可将体积变化因素低 消。查表所得的数据已经考虑了体积的变化。 四、有机溶剂沉淀法的影响因素 1、温度 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的 温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作 用。另外，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能 力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，在使用有机 溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进 行。
第二节 有机溶剂沉淀法


2、pH值 许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果，所以pH 多控制在待沉蛋白质的等电点附近。但要注意的是， 有少数蛋白质在等电点附近不太稳定。另外，在控制 溶液pH时，务必使溶液中大多数的蛋白质分子带有相 同电荷，而不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷， 以免出现严重的共沉作用。 3、样品浓度 与盐析相似，样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和 损耗，降低溶质收率，但稀的样品共沉作用小；样品 太浓会增加共沉作用，降低分辨率，然而减少了溶剂 用量，提高了回收率。（不高不低）一般认为蛋白质 的初浓度以0.5～2％为好，粘多糖则以1～2％较合适。