liu-3-蛋白质羰基含量测定实验步骤

liu-3-蛋白质羰基含量测定实验步骤
蛋白质羰基含量检测实验步骤
1.阳性对照、处理样品的制备
（①②无处理，③④抗氧化剂保护,⑤⑥阳性对照只加氧化剂）
5mg/ml BSA (pH=7.4的Tris-Hcl缓冲液)
↓①②只加pH=7.4的Tris-Hcl缓冲液
↓③④加入抗氧化剂(Trolox)，氧化剂（1mM硫酸亚铁1mM过氧化氢现加，）↓⑤⑥只加氧化剂
室温孵育30分钟
↓
已氧化BAS
↓加入1ml 20%的三氯乙酸，使终浓度为10%，漩涡振荡，1000g离心
↓10分钟，弃上清
沉淀1
2．蛋白质羰基含量的测定
注：以上三组分别有一空白对照（不与DNPH反应）
沉淀1
↓②④⑥加2ml 10mM DNPH（2M盐酸溶解），空白管①③⑤加2ml 2M盐酸，混匀，室温黑暗1小时，每10分钟漩涡振荡1次。

↓加2ml 20%三氯乙酸，振荡，1000g离心8min，弃上清
沉淀2
↓（洗涤）加2ml乙醇和乙酸乙酯混合液（V：V=1：1），摇匀？加0.7ml 20%三氯乙酸,振荡，RT, 10min。

10000g离心8分钟，弃上清
↓
沉淀3
↓洗涤过程重复一次
沉淀4
↓（显色反应）加3ml 6M盐酸胍，漩涡混合，37℃孵育15min，10000g ↓离心8min，取上清
上清
↓6M盐酸胍调零，分别276和370nm测吸光值，计算活化蛋白质羰基含量。

370为羰基最大吸收峰
276为蛋白最大吸收峰
溶液配制
1. 100mlPH=7.4的Tris(MW121)缓冲液(20mM)：称取0.24228gTris溶于80ml 蒸馏水，用稀释10倍的浓盐酸调PH至7.4，ph试纸最后定容到100ml。

（100ml 容量瓶和试剂瓶各一个）。

2. 50ml Ph=7.4的Tris缓冲液（1mM过氧化氢（9.0M），1mM 七水硫酸亚铁）:称取0.0139g七水硫酸亚铁,吸取（5.6μl） 10ul过氧化氢，用1号缓冲液溶解，最后定容至50ml。

（50ml容量瓶和试剂瓶各一个）。

现配
3. 50ml 20%三氯乙酸：称取10g三氯乙酸定容至50ml。

（50ml 容量瓶和试剂瓶各一个）。

现配
4. 50ml PH=8.5Tris-EDTA缓冲液（8
5.7mMTris,0.857mM EDTA,20mM氢氧化钠）：称取0.51908gTris，EDTA0.00519g,0.04g氢氧化钠定容至50ml。

（50ml 容量瓶和试剂瓶各一个）。

5. 50mlPH=8.5Tris-EDTA缓冲液（85.7mMTris,0.857mMEDTA,20mM氢氧化钠，20μM Trolox）：称取0.51908gTris，0.00519g,0.04g氢氧化钠定容至50ml，吸取50μl 20mM的Trolox,定容至50ml。

（50ml容量瓶和试剂瓶各一个）。

不必从新配
6. 50ml 2M盐酸：量取8.3ml 38%浓盐酸（12M），定容至50ml。

（50ml容量瓶和试剂瓶各一个）。

7. 50ml 10mM DNPH （用2M盐酸溶解）：称取0.09907g DNPH,用2M盐酸定容至50ml。

（50ml容量瓶和试剂瓶各一个）。

黑暗
8. 20ml 6M盐酸胍：称取11.46g盐酸胍，定容至20ml。

（20ml 容量瓶和试剂瓶各一个）。

9.BSA 2mg/ML的配制
10.直接吸取25ul 20mM Trolox 加入1ml反应体系中，浓度为500um 不用配注：共需试剂瓶8个，20ml容量瓶1个，50ml容量瓶6个，100ml容量瓶1个，50ml容量瓶可重复使用。

10ml离心管6支。

郑炜
2010-1-24。