实验一底物浓度对酶促反应的影响

实验一 底物浓度对酶促反应的影响

一、实验目的

掌握底物浓度对酶活性的影响，了解碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP ）的Km 值的测定原理和方法，理解Km 值的意义。

二、实验原理

在温度、pH 及酶浓度等恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。当底物浓度较低时，酶促反应速度V 随底物浓度[S]的增高而显著加快，随着底物浓度渐高，反应速度加快程度渐小，当底物浓度增加到一定程度以上时，再增高底物浓度，反应速度亦不再增加，成为该条件下极限最大反应速度Vmax 。底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米－曼（Michaclis-Menten ）氏方程式表示。

V=

][]

max [S Km S V 或Km=[S](V

V max — 1)

式中，Km 为米氏常数。当V=Vmax/2时，则Km=[S]，即米氏常数是反应速度等于最

大速度一半时底物物浓度的数值。如图所示：

Km [S]

图1 底物浓度与酶促反应速度的关系

Km 是酶的特征性常数，不同酶的Km 值不同，同一酶作用于不同底物的Km 值亦不同。大多数纯酶的Km 值在0.01～100mmol/L 之间。Km 值的测定在酶学研究中有重要的实际意义。

根据实验结果绘制上述直角双曲线，难以准确求出Km 和Vmax 值。而用米曼氏方程式的下列变换式，则容易求得Km 及Vmax 值。

米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示，则成为Lineweaver —Burk 氏方程式：

V 1=max V Km ·][1S +max

1V 如图所示：

图2 Lineweaver —Burk 氏法作图求Km 值

这是个上截式直线方程式。V 1与S

1为直线关系，如上图。直线斜率为max V Km ，纵轴

截距为max 1V ，横轴截距为－Km 1.据此可以测定不同浓度底物的反应速度，按V 1与S

1

关

系作图而容易正确得出Km 值。

另有其他变换式，例如把上式两侧皆乘以[S]，则转换成Wilkinson 氏方程式。

V S ][=max V Km +max

1

V ·[S] 如图所示：

-K m [S]

图3 Wilkinson 氏法作图求Km 值

这也是直线方程式。以

V

S ]

[为纵轴，[S]为横轴作图，则直线在横轴上的截距为－Km. Km

1

]

[1S

本实验利用磷酸苯二钠法测定不同浓度底物的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的反应速度，作图求出Km值。

AKP的催化原理为：在一定pH和温度下，待测液中的AKP作用于基质液中的磷酸苯二钠，使之水解释放出酚。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林(AAP)作用并经铁氰化钾氧化，生成红色醌类化合物。以酚作标准液同样处理显色进行比色，可测知酚的生成量，从而计算出酶的活力。

三、实验器材

试管、37℃水浴锅、可见分光光度计、座标纸。

四、实验试剂

1、0.04mol/L基质液

称取磷酸苯二钠 2H2O 10.16g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000mL。加4mL氯仿防腐贮于棕色瓶中冰箱保存，可用一周。

2、0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液（含0.3% 4-氨基安替比林）

称取4-氨基安替比林（AAP）3g，用0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液溶解并稀释至

1000mL，放棕色瓶内，冰箱保存。

3、酚标准液（1mg/mL）与酚标准应用液（0.1mg/mL）

①酚标准液（1mg/mL）：称取结晶酚1.0克溶于0.1N盐酸至1000mL。

②酚标准应用液（0.1mg/mL）：准确吸取酚标准贮存液（1mg/1mL）10.0 mL于100mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，贮存冰箱中可保存一个月。

4、0.5％铁氰化钾溶液

称取5g铁氰化钾和15g硼酸，分别溶于400mL蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000mL，置于棕色瓶中暗处保存。

5、0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液(37℃时)

称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，稀释至1000mL。

6、0.01mol/L pH8.8 Tris缓冲液

称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1g，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，此即为0.1mol/L Tris溶液。取上液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后用１%醋酸调pH到8.8，用蒸馏水稀释至1000mL。

7、酶液

AKP（10mg，10U/mg）用0.01mol/L Tris缓冲液稀释成每mL含0.7—1.0单位的酶溶液。

五、实验操作

取干净试管8支，编号，按下表操作。特别注意准确吸取酶液、基质液及标准液。

以B管调零，读记在510nm处的各管光密度值OD，并填入下表，计算有关数据并作图。如按林贝氏法可如下进行：

列表并计算记入各有关数据。

底物浓度对酶促反应的影响

(1) 计算出各管的酶活性单位OD t /OD s ×0.01，此数代表反应速度（V ）。

(2) 计算出各管底物浓度：基质液浓度×酶反应总液量加基质液量=0.04×1

.3加基质液量

(3) 进一步计算出各管的1/V 及1/[S]值。

作图：以1/[S]为横坐标，以1/V 为纵坐标，在方格坐标纸上准确画出各管坐标点，连接各点画出直线，向下延长线与横轴交点为-1/Km 值。计算出Km 值。

六、思考题

联系实验结果，讨论底物浓度对酶促反应的影响。