实验二：ERIC-PCR指纹图谱技术ppt课件
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退火温度低于40℃
单个或一对长度大 于16bp的引物
退火温度高于52℃
图谱稳定、重复性高，对底物 的序列差异敏感性高，产生的
图谱多态性丰富 4
PCR反应的一般原理
PCR: 聚合酶链式反应，即通过引物延伸核酸的某
个区域而进行的重复双向DNA合成。 基本要素：
• DNA模板 • 一对寡聚DNA引物（启动DNA扩增） • Taq DNA聚合酶（催化DNA合成） • 缓冲液（提供DNA合成所需pH、离子强度等环境） • dNTP（DNA合成的原料）
gillings1997aericpcr不只针对eric序列实际上是一种长引物随机pcrlprapddigiovanni1999用ericpcr分高平平2003wei2004将ericpcr方法引入复杂环境微生物群落的研究ericpcrpcr普通rapdlprapd引物常为810bp的单个引物单个或一对长度大于16bp的引物退火温度低于40退火温度高于52图谱稳定重复性高对底物图谱稳定重复性高对底物的序列差异敏感性高产生的的序列差异敏感性高产生的图谱多态性丰富图谱多态性丰富pcr反应的一般原理pcr
5. 放入PCR扩增仪 ，按以下程序进行扩增： 94℃ 1 min，52℃ 1 min, 65℃ 8 min，共30个循环； 65℃延伸16min，1个循环。
10
6. 程序结束（约6.5h),取出PCR小管 7. 吸取2μl扩增产物用浓度仪测定浓度
8. 400ng PCR产物电泳 9. 凝胶成像，保存图谱
PCR原理
5
ERIC-PCR程序
• 95℃, 7min • 94℃, 1min (变性)
52℃, 1min (退火) 68℃, 8min (延伸) • 65℃, 16min
30 cycles6Leabharlann 1. 试剂实验材料
无菌水
25 mmol/L MgCl2溶液 10×扩增缓冲液:
含500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (PH9.0), 1% TritionX-100
首次在肠道细 菌基因组中发 现ERIC序列
Versalovic,1 991
发明ERICPCR，对细菌 的基因组DNA进 行指纹图分析
Gillings,1997b
ERIC-PCR可以从 植物、动物、真 菌等的基因组 DNA中扩增出稳 定的、多态性丰
富的图谱。
高平平,2003
Wei,2004
将ERIC-PCR 方法引入复杂 环境微生物群 落的研究
13 μl 2.5μl 2.0μl 2.0μl 0.5μl 0.5μl
20.5 μl
2. 加入模板DNA（40ng） 4.0μl
NC 样品 PC
24.5 μl
9
3. 放入PCR扩增仪，95℃变性7min 4. 取出PCR小管，迅速加入0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀，
简短离心。（后加酶可保证模板变性完全且不损坏Taq DNA聚合酶的活性）
Di Giovanni, 1999
用ERIC-PCR分 析混合菌群的组 成
Gillings,1997a
ERIC-PCR不只 针对ERIC序列， 实际上是一种 “长引物随机 PCR (LP-RAPD)”
3
ERIC-PCR是一种长引物随机PCR技术
普通RAPD
LP-RAPD
引物常为8-10bp的单 个引物
2.5 mmol/L dNTP混合液
20pmol/μl 引物E1
20pmol/μl 引物E2
5 U/μl Taq DNA聚合酶
DNA模板（40-80ng环境样品总DNA）
7
2. 仪器设备
8
实验步骤
1. 制备PCR mixture (25μl system)
无菌水
10× buffer 25 mmol/μl MgCl2溶液 2.5 mmol/L dNTP混合液 20pmol/L 引物E1 20pmol/L 引物E2
11
结果：
Mr NC S PC
12
注意事项
• 避免污染
–PCR体系中所有试剂必须保证无其它杂菌DNA的污染。 –制备PCR混合物的操作应在超净台上进行。 –打开PCR扩增小管时切勿用手指接触管盖内侧。 –用移液器吸取试剂时要轻吸轻放。
• 定量
–模板DNA的量一致 –电泳时PCR产物上样量一致
13
实验二 ERIC-PCR指纹图谱技术 在分子
生态学中的应用
1
实验目的
• 明确ERIC-PCR技术用于分析微生物群 落结构的原理。
• 掌握ERIC-PCR的操作方法。
2
ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-PCR
Hulton,1991
单个或一对长度大 于16bp的引物
退火温度高于52℃
图谱稳定、重复性高，对底物 的序列差异敏感性高，产生的
图谱多态性丰富 4
PCR反应的一般原理
PCR: 聚合酶链式反应，即通过引物延伸核酸的某
个区域而进行的重复双向DNA合成。 基本要素：
• DNA模板 • 一对寡聚DNA引物（启动DNA扩增） • Taq DNA聚合酶（催化DNA合成） • 缓冲液（提供DNA合成所需pH、离子强度等环境） • dNTP（DNA合成的原料）
gillings1997aericpcr不只针对eric序列实际上是一种长引物随机pcrlprapddigiovanni1999用ericpcr分高平平2003wei2004将ericpcr方法引入复杂环境微生物群落的研究ericpcrpcr普通rapdlprapd引物常为810bp的单个引物单个或一对长度大于16bp的引物退火温度低于40退火温度高于52图谱稳定重复性高对底物图谱稳定重复性高对底物的序列差异敏感性高产生的的序列差异敏感性高产生的图谱多态性丰富图谱多态性丰富pcr反应的一般原理pcr
5. 放入PCR扩增仪 ，按以下程序进行扩增： 94℃ 1 min，52℃ 1 min, 65℃ 8 min，共30个循环； 65℃延伸16min，1个循环。
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6. 程序结束（约6.5h),取出PCR小管 7. 吸取2μl扩增产物用浓度仪测定浓度
8. 400ng PCR产物电泳 9. 凝胶成像，保存图谱
PCR原理
5
ERIC-PCR程序
• 95℃, 7min • 94℃, 1min (变性)
52℃, 1min (退火) 68℃, 8min (延伸) • 65℃, 16min
30 cycles6Leabharlann 1. 试剂实验材料
无菌水
25 mmol/L MgCl2溶液 10×扩增缓冲液:
含500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (PH9.0), 1% TritionX-100
首次在肠道细 菌基因组中发 现ERIC序列
Versalovic,1 991
发明ERICPCR，对细菌 的基因组DNA进 行指纹图分析
Gillings,1997b
ERIC-PCR可以从 植物、动物、真 菌等的基因组 DNA中扩增出稳 定的、多态性丰
富的图谱。
高平平,2003
Wei,2004
将ERIC-PCR 方法引入复杂 环境微生物群 落的研究
13 μl 2.5μl 2.0μl 2.0μl 0.5μl 0.5μl
20.5 μl
2. 加入模板DNA（40ng） 4.0μl
NC 样品 PC
24.5 μl
9
3. 放入PCR扩增仪，95℃变性7min 4. 取出PCR小管，迅速加入0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀，
简短离心。（后加酶可保证模板变性完全且不损坏Taq DNA聚合酶的活性）
Di Giovanni, 1999
用ERIC-PCR分 析混合菌群的组 成
Gillings,1997a
ERIC-PCR不只 针对ERIC序列， 实际上是一种 “长引物随机 PCR (LP-RAPD)”
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ERIC-PCR是一种长引物随机PCR技术
普通RAPD
LP-RAPD
引物常为8-10bp的单 个引物
2.5 mmol/L dNTP混合液
20pmol/μl 引物E1
20pmol/μl 引物E2
5 U/μl Taq DNA聚合酶
DNA模板（40-80ng环境样品总DNA）
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2. 仪器设备
8
实验步骤
1. 制备PCR mixture (25μl system)
无菌水
10× buffer 25 mmol/μl MgCl2溶液 2.5 mmol/L dNTP混合液 20pmol/L 引物E1 20pmol/L 引物E2
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结果：
Mr NC S PC
12
注意事项
• 避免污染
–PCR体系中所有试剂必须保证无其它杂菌DNA的污染。 –制备PCR混合物的操作应在超净台上进行。 –打开PCR扩增小管时切勿用手指接触管盖内侧。 –用移液器吸取试剂时要轻吸轻放。
• 定量
–模板DNA的量一致 –电泳时PCR产物上样量一致
13
实验二 ERIC-PCR指纹图谱技术 在分子
生态学中的应用
1
实验目的
• 明确ERIC-PCR技术用于分析微生物群 落结构的原理。
• 掌握ERIC-PCR的操作方法。
2
ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-PCR
Hulton,1991