生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告

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《生物化学与生物分子学实验》——分子生物学设计性实验开题报告
实验课题:绿色荧光蛋白的基因克隆及表达
指导老师:
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小组编号：
小组成员:
完成时间：
成都医学院
Cheng Du Medical College
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达
立题依据：
随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1].
1.选材：大肠杆菌
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点.而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 ％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

2.基因标记技术
基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。

荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。

荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白［2］.
3。

绿色荧光蛋白
从水母（Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。

分子质量为
26kDa，由238个氨基酸构成,第65～67位氨基酸(Ser-Tyr—Gly）形成发光团，是主要发光的位置。

其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光.绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因.
【实验目的】
研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达.
【研究意义】
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达.通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。

根据电泳结果及荧光现象得出结论,重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。

GFP的应用特点
检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。

实验题目包含的内容
本实验的目的是通过BamH I和Not I两种限制性内切酶的消化把EGFP 基因从pEGFP-N3质粒中克隆出来，或者用PCR方法把EGFP基因从pEGFP—N3质粒中扩增出来。

并定向插入到表达载体pET—28a质粒的多克隆位点（MCS）中，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3),在IPTG的诱导下表达出带有N端His-Tag的融合蛋白。

表达了GFP的菌体在离心管中则会呈黄绿色,在紫外光激发下发射出特异的绿色荧光，从而证明了目的蛋白的表达是否成功.另外在菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中如果出现了明显的诱导条带，则条带中蛋白浓度与诱导时间呈正相关。

【根据现有的知识和技能来设计进行实验】
1。

查询两个质粒特点的资料:
•pEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移(荧光波长较大)变异体蛋白，具有更强的荧光（在485nm激发下比野生型强35倍)和在哺乳动物细胞中有较好的表达。

激发峰在488nm，发射峰在
507nm。

•pET-28a质粒载体上面携带一个N—terminal His Tag／Thrombin／T7 tag结构以及一个可以选择的C—terminal
HisTag.克隆表达区域的编码框由T7RNA聚合酶转录。

2。

根据查询的资料,确定两种途径可以到达目标
第一种方法：用限制性内切酶方法，如果选定内切酶的方式去做实验，如何选择内切酶，选哪种内切酶即合用又经济。

根据两个质粒结构的特点，要在多种内切酶中进行选择，考虑pEGFP片段完整又考虑到被克隆的目标载体表达区域的编码框正确性。

使用Notl酶,Bamhl酶，这是一对最合适的内切酶。

第二种方法:用PCR基因扩增方式达到目的.如果用PCR方法去做实验，必需根据pEGFP的序列设计引物。

【实验原理】
1。

质粒重组：先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成.
2.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性——退火—-延伸三个基本反应步骤构成。

合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火-—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需 2～4分钟，2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR 技术是Kary Mullis 在1985 年建立起来的在细胞体外合成DNA 的一种方法.依DNA 半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA 模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA 片段,包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA 的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5’端限定的特异性片段形成指数式积累.整个过程操作简单,可在短时间内在小管中获得大量的特意的DNA 拷贝，这一特点使PCR 技术很快被应用到了分子生物研究的广大领域［3］.
【参考文献】
［1] 梁国栋。

最新分子生物学实验技术［ M］ . 北京: 科学技术出版社, 2001, 174。

［2］贾艳华，李国勋，张杰荧光蛋白及其应用
[3] 魏春红，李毅主编聚合酶链反应———-PCR 现代分子生物学
技术高等教育出版社，2006.7：45-46
【研究方案】
通过分别将DH—5α (pEGFP-N3)和DH—5α（pET-28a）提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a—GFP,将重组质粒导入E.coli DH—
5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL—21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，根据观察是否可以看到显现绿色,判断GFP基因是否在大肠杆菌中成功表达。

【关键词】
绿色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达
【技术路线及实验方案】
【实验材料及试剂】
注：最初始的两个质粒pEGFP—N3质粒，pET—28a质粒.
1。

实验材料
克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL—21,质粒 pET—28a 和 pEGFP—N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not Ⅰ。

2.实验试剂
SIM—f140 SANYO Eppendof离心机电泳仪电子天平台式离心机控温磁力搅拌器调温电热套 pH计冰箱台式冷冻恒温振荡器
手提紫外灯生物洁净工作台琼脂糖凝胶电泳电泳装置
电热恒温水温箱凝胶成像分析系统酒精灯培养皿移液枪枪头接种环酒精棉球灭菌枪头 Parafilm膜离心管 IceMaker
【实验方法】
•重组质粒的构建
•DH-5α和BL-21感受态细胞的制备
•感受态细胞的转化
•碱法提质粒
•酶切鉴定
•琼脂糖凝胶电泳
•PCR-聚合酶链式反应
•Pet—28a—GFP重组质粒转化到表达菌BL—21
•重组绿色荧光蛋白（GFP)的诱导表达
【具体实验步骤】
1。

重组质粒的构建
重组质粒pET—28a-GFP的构建流程
2. DH-5α和BL-21感受态细胞的制备
1)将0～4 ℃保存的DH-5α和BL—21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养
16 h 。

2)将分别接种过夜菌：LB按1：50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2~3 h至
OD=0.3～0.5 .
3)取1。

5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min.弃上清液,
沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌.冰上放置15—30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。

4)弃上清液，沉淀用0。

1 mL预冷的0。

1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱
内保存。

3。

感受态细胞的转化
取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。

2) 加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。

3) 42 ℃水浴中热击70 sec后,冰上放置2 min。

4) 加入200 μl LB液体培养基,37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。

5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布,平皿正放静置1—2 h后,封口膜封好平皿， 37 ℃培养倒置12-16 h。

4.碱法提质粒
1）感受态细胞经转化培养后,平皿内有但菌落长出。

2) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中,37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。

3) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃、11000 r/min 离心1分钟,吸弃上清.
4）向离心管中加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀.
5）加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口,快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。

6）加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅲ,轻轻混匀,冰上放置3~5分钟。

7）用微量离心机于4 ℃、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。

8) 加等体积氯仿400 μl抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

9）吸取上清液300 μl，向上清中加入2倍体积的无水乙醇,混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心5分钟，弃上清。

10）用70％乙醇洗涤2次，再次4 ℃、11000 rpm离心5分钟,沉淀于空气中干燥。

向已干燥的离心管内加20 μl超纯水溶解质粒DNA,加入2 μl 10 mg/ml RNA酶，37 ℃处理1小时后于-20 ℃贮存. 5。

酶切鉴定
1）取提取的质粒8 μl于另一微量离心管中,加入2 μl Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。

2) 离心，使溶液聚集在管底部 3) 37 ℃，酶切反应。

6. 琼脂糖凝胶电泳
1) 称取0。

8 g琼脂糖,放入到锥形瓶中,加入100 mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 ℃左右。

2）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1—1。

5毫米，轻轻拔除梳子。

4）吸取10 μl的质粒与2 μl的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔.
5）接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V， I=30 mA.
6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2 cm处,停止电泳。

7) 在凝胶成像分析系统中观察结果。

7. PCR—聚合酶链式反应
1）将PCR管放置在冰盒上,按如下表格加入PCR反应体系各成分
PCR反应体系各成分的量
template 0。

1 μl
P1(20 mM）0。

2 μl
P2(20 mM）0.2 μl
dNTPs(10 mM) 0.4 μl
Taqs(5 U/μl) 0。

2 μl
10×PCR buffer 2 μl
ddH2O 16.9 μl
Total 20 μl
2) 将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数.预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 30 s，退火60-
55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 10个循环，每个循环降0。

5 ℃.变性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30
s，延伸72 ℃ 1 min 20个循环，72 ℃延伸 2 min。

3) PCR扩增完毕后,取出PCP管放在冰盒上。

4) 取8 l扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测.
8。

pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21
1) 取100 μl感受态BL—21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。

加入2 μl经过酶切鉴定成功提取重组
质粒pET-28a—GFP，轻轻混匀,冰上静置10-30 min.
2）42℃水浴热激70 s,冰上放置2 min。

3) 加入200 μl 含抗生素的LB液体培养基，37 ℃，60 r/min震荡培养30 min。

四支EP管中加入0.5 μl 的100 mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPTG诱导。

4) 吸取200 μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上,用涂布器均匀涂布,平皿正放静置1-2 h后，封口
膜封好平皿，37 ℃培养倒置12-16 h.
9. 重组绿色荧光蛋白(GFP）的诱导表达
1）取GFP重组菌接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l）中，37 ℃ 150-220 r/min过夜培养。

2) 将20 μl菌液按1：50-100接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 ℃ 200r/min培养2h. 3）按IPTG: LB培养基按1：1000加入2 μl的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。

4) 用紫外线照射菌体沉淀,保存照片。

【预期结果与分析】
1。

提取质粒
加入溶液1浑浊；
加入溶液2变澄清;
加入溶液3出现白色絮状沉淀;
加入氯仿抽提溶液分层
2. 重组质粒构建的鉴定
Lane1：Marker protein（标记蛋白)；
Lane 2:含目的基因的重组质粒,得到有两条带,可知前面第一条带为GFP基因片段，第二条带为质粒载体,故成功构建了重组质粒pET—28a—GFP.
3。

PCR检测结果
PCR扩增后产物经过电泳检测，如果可以看到明显的一条亮带，则可知eGFP基因成功连接到pET—28a载体。

如果其前面有不明显的弥散的条带,则为引物二聚体.
4。

IPTG诱导表达
分别在日光灯和紫外光下进行照射,如果携带重组质粒pET-28a—GFP的大肠杆菌BL-21用IPTG诱导表达后呈现绿色，说明含外源基因GFP的质粒在大肠杆菌BL—21体内成功表达；而没有经IPTG诱导的菌体则不发出绿色荧光.
【讨论】
如果重组质粒转化率不高，其原因可能有以下几点：
（1)生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生感受态，转化时菌浓度应控制在不超过107个/ml.浓度过高或者过低都会影响转化效率。

（2）CaCl2法0 ℃放置时间的影响:细菌经0 ℃ CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加，24 h达到最高,之后转化率逐渐下降。

(3）化合物及无机离子的影响:在钙离子的基础上，联合其他二价金属离子或还原剂等物质处理细菌，可使转化率提高100—1000倍。

（4)质粒大小、构型的影响：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低.1 ng超螺旋DNA即可使50 ul的感受态细胞达到饱和。

一般情况下DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％.
(5）防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在冰浴低温和无菌条件下进行，所用器皿,如离心管、EP管等均应彻底洗净，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦.
(6）试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

（7）42 ℃热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热处理过程中离心管不要摇动。

(8）菌液涂平皿操作时，应避免反复来回涂，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

在重组质粒转化BL—21 细胞后，如果在平皿中用IPTG诱导长出菌苔,但未出现单菌落，可能的原因：
（1)菌液没有涂开；
（2）涂完后未先正放1h使菌液充分被LB吸收；
（3）平皿上有水珠,未除去;
（4)摇菌时间过长,菌过多。

【心得体会】
本实验设计是一个综合性的，与我们平时实验经历相比对我们的要求更多更严。

它主要要求我们形成认真思考的习惯，自己查阅本实验的相关文献，分析本实验的目的，通过本实验要达到什么样的结果，达到预计的结果需要通过怎样的方案实现，根据实验需要和自己的相关了解自己设置适合的实验方案，增强我们的思维能力和动手能力,同时也使我们的团队合作精神得到了提高，并学会把我们所学的知识有机的结合到一起。