沙棘汁总黄酮测定方法的对比分析

收稿日期:2018-10-31
基金项目:农业部公益性行业(农业)科研项目(201303073)
第一作者:孙雪皎(1994-),女,硕士研究生,从事果蔬深加工研究,E-mail:291593789@ 通信作者:颜廷才(1977-),男,博士,副教授,从事果蔬深加工研究,E-mail:ytc126127@
沙棘汁总黄酮测定方法的对比分析
孙雪皎,史
琳,张旋,孟宪军,颜廷才
(沈阳农业大学食品学院,沈阳110161)
摘
要:为确立适合沙棘汁总黄酮测定的方法,更好地开发沙棘汁的营养功效,以沙棘汁为试验材料,研究沙棘汁总黄酮NaNO 2-
Al(NO 3)3-NaOH 显色法、AlCl 3-CH 4O 显色法以及紫外分光光度法3种检测方法的准确度与加标回收率,并采用高效液相法对检测结果进行验证,找出最佳方法。

结果表明:NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法、AlCl 3-CH 4O 显色法以及紫外分光光度法检测波长分别
为510,420和350nm。

芦丁可作为3种检测方法的标准品。

在浓度范围内,每个方法的标准曲线线性关系良好,相关系数高;测出的沙棘汁总黄酮含量分别为1.19,0.42和2.47mg ·mL -1,RSD 值分别为7%,25%和7%,加标回收率平均值分别为97%,147%和99.6%。

本试验确立的高效液相色谱条件,可以较好地分离芦丁、槲皮素、异鼠李素3种对照品;沙棘汁中分离出多个黄酮组分,黄酮苷元在沙棘中相对含量较少,大部分以黄酮糖苷形式存在。

芦丁可作为高效液相法的标准品,标准曲线的相关系数R 2为0.9999,浓度在0~160μg ·mL -1时存在良好的线性关系,测定沙棘汁中总黄酮含量为2.49mg ·mL -1。

可见,NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法、AlCl 3-CH 4O 显色法测定沙棘汁总黄酮的结果准确度较低,与高效液相验证结果比较偏差较大,都在50%以上,且需要额外添加化学试剂;紫外分光光度法结果准确度高,偏差只有1%,该方法无需额外添加化学试剂,对环境污染少,操作简便,是测定沙棘
汁总黄酮含量的理想方法,该方法为沙棘总黄酮测定与功能性食品开发提供一定参考。

关键词:沙棘汁;总黄酮;检测方法;显色法;紫外法中图分类号:S793.678
文献标识码:A
文章编号:1000-1700(2019)01-0120-08
Comparison on Determining Methods for the Total
Flavonoids in Sea Buckthorn Juice
SUN Xue-jiao,SHI Lin,ZHANG Xuan,MENG Xian-jun,YAN Ting-cai
(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China)
Abstract :The object of this study is to confirm the ideal method of determining total flavonoids in sea buckthorn juice to develop its nutrition effects.The accuracy and recovery rates of NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH coloration method,AlCl 3-CH 4O coloration method and UV spectroscopy method for determining total flavonoids were explored by using sea buckthorn juice as material,and their determining results were tested with HPLC determination result to confirm the ideal method.The result indicated that the determining wavelengths were 510nm,420nm and 350nm in the NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH coloration method,AlCl 3-CH 4O coloration method and UV spectroscopy method,respectively.Rutin can act as the standard in three methods,and the standard curves have good linearity and correlation coefficient in reasonable concentration.The determining results of the total flavonoids were 1.19,0.42and 2.47mg ·mL -1;the RSD values were 7%,25%and 7%;the average recovery rate were 97%,147%and 99.6%.The standards of rutin,quercetin,and isorhamnetin could be separated by HPLC under the confirmed conditions.Many constituents were separated from the sea buckthorn juice with HPLC under the same conditions.There were many flavonoid glycosides but little aglycones.Rutin can act as standard control in HPLC method.The correlation coefficient of the standard curve was 0.9999.The linearity was very good between the concentration 0-160μg ·mL -1.The determining result of total flavonoids was 2.49mg ·mL -1
with HPLC.It could be concluded that the results of NaNO 2-Al (NO 3)3-NaOH coloration method and AlCl 3-CH 4O coloration method were not accurate comparing with the result of UV spectroscopy method,the deviation got to over 50%,these two methods needed additional chemical reagents.The result accuracy of the UV spectroscopy method was very high,the deviation was only 1%.What's more,t his method could be operated easily,used little additional chemical reagents,which was an
孙雪皎,史
琳,张
旋,等.沙棘汁总黄酮测定方法的对比分析[J].沈阳农业大学学报,2019,50(1):120-127.
沈阳农业大学学报,2019,50穴1雪:120-127Journal of Shenyang Agricultural University
http ://
DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2019.01.016
孙雪皎等院沙棘汁总黄酮测定方法的对比分析
第1期--
沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡颓子科(Elaeagnaceae)酸刺属灌木[1]。

沙棘营养丰富,成熟的果实中富
含多种维生素、类固醇、黄酮类化合物、氨基酸等[2-3]。

沙棘中富含黄酮,具有防癌抗癌的作用[4-5],并对提升心脑血管系统、免疫系统等也都有显著的功效[6-7],还可以降低血糖、血脂,对糖尿病和高血脂并发症起到一定治疗作用[8]。

我国是全世界沙棘资源最丰富的国家[9-10],也是沙棘应用最早的国家,藏药、蒙药[11]文献中都记录了其药用价值[12-13]。

黄酮类化合物总含量的确定对于分析沙棘成分与产品加工都具有重要意义。

目前,黄酮类化合物的分
离以及单一黄酮成分的定量分析,常采用高效液相色谱法。

但对于测量黄酮总量,通常采用分光光度法[14-15]。

分光光度法主要有AlCl 3-CH 4O 显色法、NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法以及紫外法。

对于沙棘中总黄酮的测定目前没有国标方法。

刘锡建等[16]采用AlCl 3络合方法测量了榨油后的沙棘果渣的总黄酮含量为0.53%,并发现主
要有异鼠李素和槲皮素两种苷元。

回瑞华等[17]采用三氯化铝显色,3波长光谱法测定沙棘果汁饮料黄酮含量为31.7μg ·mL -1。

孟晓等[18]采用乙醇作为提取剂,Al(NO 3)3络合法显色法测量沙棘枝叶总黄酮含量为8.02%。

吕敏[19]
采用乙醇浸提沙棘叶,硝酸铝显色法测定黄酮含量达到4.8%。

紫外法测定黄酮是药监部门推荐方法,近年来在沙棘总黄酮的测定中也有应用,主要测定的是沙棘黄酮粉或者水解糖苷以后的总黄酮含量,主成分是黄酮苷元。

张慧娟等[20]采用紫外法测量沙棘果肉黄酮中总黄酮含量为42%,沙棘籽黄酮中总黄酮的含量为15.8%,并发现沙棘果肉中主要苷元为异鼠李素、槲皮素和山奈酚。

在生产过程中发现,对沙棘汁而言,这些铝盐显色方法测定的结果普遍偏低,总黄酮含量的测定结果差异较大。

本研究系统比较这3种测定方法的测定波长、标准曲线以及测定结果,并采用高效液相方法验证测定结果,探讨出更适合沙棘汁黄酮总量测定的方法,这对沙棘总黄酮测定与功能性食品开发将具有实践和指导意义。

1材料与方法
1.1样品与试剂
样品(沙棘汁):2018年1月份在辽宁省朝阳市建平县采收成熟的沙棘果实,经压榨后过滤灭菌包装处理,制备试验所需沙棘汁,封存于冰箱备用。

主要试剂:芦丁(YZ-100080,HPLC>98%,索莱宝),槲皮素(YZ-100081,HPLC>98%,索莱宝,117-39-5),异鼠李素(YZ-1120S,HPLC>98%,索莱宝),氯化铝,硝酸铝,亚硝酸钠,氢氧化钠,无水乙醇,甲醇均为分析纯。

标准品溶液制备:准确称取20mg 芦丁加2mL 甲醇溶解,稀释10倍,得到1mg ·mL -1芦丁。

再稀释20倍,制备50μg ·mL -1芦丁溶液。

同样,称取槲皮素、异鼠李素,分别稀释,制备1mg ·mL -1与50μg ·mL -1槲皮素溶液;也制备出1mg ·mL -1与50μg ·mL -1异鼠李素溶液。

试剂制备:准确称取5g 氯化铝加乙醇溶解,定容至100mL,制备浓度为50mg ·mL -1的氯化铝无水乙醇溶液。

称取10g 硝酸铝加蒸馏水溶解,定容至100mL,制备浓度为100mg ·mL -1的硝酸铝溶液。

称取5g 亚硝酸钠加蒸馏水溶解,定容至100mL,制备浓度为50mg ·mL -1的亚硝酸钠溶液。

称取4g 氢氧化钠加蒸馏水溶解,定容至100mL,制备浓度为40mg ·mL -1的氢氧化钠溶液。

1.2主要仪器与设备
电子天平(AX124ZH/E,奥豪斯仪器(常州)有限公司);高效液相色谱仪(1525,美国Waters);紫外可见分光光度计(VARIAN Cary50)。

1.3试验方法与处理
1.3.1NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法最大吸收波长的确定:将沙棘汁样品离心处理后稀释10倍,准确吸取处理后1.0mL 样品于10mL 容量瓶中,加50mg ·mL -1NaNO 2溶液0.3mL,摇匀,放置6min,加100mg ·mL -1Al(NO 3)3溶液0.3mL,摇匀,放置6min,加40mg ·mL -1NaOH 溶液4.0mL,用无水乙醇定容,摇匀,在1.0cm 的吸收池中于200~800nm 进行全波长扫描。

同理,准确吸取1.0mg ·mL -1芦丁0.2mL 于10mL 容量瓶中,以下操作同沙棘汁样品操作处理,最后也在200~800nm 进行全波长扫描,对比芦丁与沙棘汁波长扫描图,确立最大吸收峰,并确定
environment-friendly method.So it was the ideal method of determining total flavonoids in sea buckthorn juice.Key words :sea buckthorn juice;total flavonoids;detection method;coloration method;UV method
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芦丁是否可作为标准品。

标准曲线建立:分别准确吸取1.0mg·mL-1芦丁0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL于6个10mL容量瓶中,以下操作同沙棘汁样品操作处理,在1.0cm的吸收池中于所确立波长处测定吸光度,绘制标准曲线。

样品的测定:将沙棘汁样品离心处理后稀释10倍,准确吸取处理后1.0mL样品于10mL容量瓶中,在1.0cm的吸收池中于所确立波长处测定吸光度。

以样品的吸光度通过标准曲线计算总黄酮的含量,进行5次平行测定。

1.3.2AlCl3-CH4O显色法最大吸收波长的确定:将沙棘汁样品离心处理后,准确吸取1.0mL样品于25mL 容量瓶中,加
2.5mL50mg·mL-1的AlCl3无水乙醇溶液,摇匀,用甲醇定容,静置20min后,于200~800nm进行全波长扫描。

准确吸取50μg·mL-1芦丁2.0mL于25mL容量瓶中,以下操作同沙棘汁样品操作处理,最后也在200~800nm进行全波长扫描,对比芦丁与沙棘汁波长扫描图,确立最大吸收峰,并确定芦丁是否可作为标准品。

标准曲线建立:分别准确吸取50μg·mL-1芦丁0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0mL于6个25mL容量瓶中,分别加2.5mL50mg·mL-1的AlCl3无水乙醇溶液,摇匀,用甲醇定容,静置20min后,于所确立波长处测定吸光度,绘制得标准曲线。

样品测定:准确吸取1.0mL离心后沙棘汁样品于25mL容量瓶中,按上述方法于所确立波长处测定吸光度,以样品的吸光度通过标准曲线计算总黄酮的含量,进行5次平行测定。

1.3.3紫外分光光度法最大吸收波长的确定:将沙棘汁样品离心处理后稀释10倍,准确吸取1.0mL样品于10mL容量瓶中,用乙醇定容,摇匀,于200~800nm进行全波长扫描。

准确吸取50μg·mL-1芦丁
2.0mL于10mL 容量瓶中,加乙醇定容至刻度,摇匀,在200~800nm进行全波长扫描,对比芦丁与沙棘汁波长扫描图,确立最大吸收峰,并确定芦丁是否可作为标准品。

标准曲线建立:分别准确吸取50μg·mL-1芦丁0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL于6个10mL容量瓶中,加乙醇定容至刻度,摇匀,在所确立波长处进行吸光度的测定,对测得的数据进行直线回归方程的分析,绘制标准曲线。

样品测定:将沙棘汁样品离心处理后稀释10倍,准确吸取1.0mL样品于10mL容量瓶中,用乙醇定容。

将此液于所确立波长处测定吸光度,以样品的吸光度通过标准曲线计算总黄酮的含量,进行5次平行测定。

1.3.4HPLC法测定黄酮沙棘汁黄酮的提取:200mL原浆─离心─石油醚萃取除杂─无水乙醇提取(1∶1,50℃, 2h)─旋转蒸发─大孔树脂─冷冻干燥─密封备用。

黄酮标准品的分离检测:分别准确吸取1mg·mL-1芦丁、槲皮素、异鼠李素标准品溶液各1mL,混匀后,用0.22μm滤膜过滤,用HPLC进行黄酮的测定,考查高效液相分离检测标准品的情况。

沙棘汁总黄酮的检测:取0.01g冻干的黄酮粉末,加入甲醇,定容到1.5mL离心管中,用0.22μm滤膜过滤,用HPLC进行黄酮的测定,考查标准品的分离情况,确定是否分离出标准品,确立作为标准品的样品,根据标准曲线确定总黄酮含量。

标准曲线建立:采用4,10,20,40,80,160μg·mL-1的5个梯度的标曲溶液制作标准曲线。

以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标。

所有测定均进行5次平行测定。

色谱条件:迪马Diamonsil C18色谱柱(250×.6mm,5μm);检测波长:350nm;柱温:25℃;流速:0.7mL·min-1;进样量10μL;流动相:A为0.1%的乙腈;B为0.1%的甲酸水溶液;梯度洗脱程序:0~45min A:0%~45%;45~ 47min A:45%~0%;47~52min A:0%。

1.3.5加标回收率试验分别测定不同方法的加标回收率,考查不同测定方法的准确程度。

操作步骤如下: NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法中,准确吸取3份1.0mL处理的沙棘汁样品,分别加入0.1,0.2,0.3mL1mg·mL-1芦丁标品,AlCl3-CH4O显色法和紫外分光光度法,准确吸取3份1.0mL处理的沙棘汁样品,分别加入1,2,3mL 50μg·mL-1芦丁标品,按照该方法标准曲线的制作步骤,在各自的检测波长下测定吸光度,通过标准曲线计算总黄酮的含量,进行5次平行测定。

2结果与分析
2.1最大吸收波长的确定
为得到较高的灵敏度,应选择波峰曲线较宽、分布均匀的最大吸收峰作为测定波长[21]。

在NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系中由于碱性条件使吸收更向红移,溶液颜色出现红色,最大吸收峰应该在500nm。

由图1和图2
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的扫描图谱可知,NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法中芦丁标品溶液和沙棘汁样品溶液都在510nm 处出现最大吸收峰,最大吸收峰比较宽,曲线平滑,可以作为测定最大吸收峰,这与很多报道相似[22-24]。

在AlCl 3-CH 4O 体系中,由于中性条件,吸收波长应该稍短。

图3和图4是AlCl 3-CH 4O 显色法中芦丁标品试液和沙棘汁样品试液的波长扫描图谱。

由此可以看出,两者都在420nm 处有较大吸收峰,波峰较宽且平滑,因此在此体系中选择检测波长为420nm 作为检测波长。

紫外分光光度法中对芦丁标品溶液和沙棘样品溶液扫描过程中发现,分别在紫外
光谱区260nm 与350nm 处都有明显的平滑吸收峰(图5和图6),因为沙棘及其饮料中含有脂肪酸、脂类、酚类等化合物,在260nm 处均有一定程度的吸收,会对黄酮的测定产生干扰,所以紫外检测法检测波长选择为
图1NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法芦丁的波长扫描图
Figure 1Scanning spectrum of rutin in NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOHcoloring method
图2NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法沙棘汁的波长扫描
Figure 2Scanning spectrum of sea-buckthorn in NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH coloring method
图3AlCl 3-CH 4O 显色法芦丁的波长扫描图Figure 3Scanning spectrum of rutin in AlCl 3-CH 4O coloring method method
图4AlCl 3-CH 4O 显色法沙棘汁的波长扫描图Figure 4Scanning spectrum of sea-buckthorn
in AlCl 3-CH 4O coloring
图5紫外分光光度法芦丁的波长扫描图Figure 5Scanning spectrum of rutin
in UV method 图6紫外分光光度法沙棘汁的波长扫描图Figure 6Scanning spectrum of sea-buckthorn
in UV method
0.50.40.30.20.10300
400
500600700
800
波长Wavelength/nm
1.5
1.0
0.5
0300
400500600700800
波长Wavelength/nm
200
0.200.150.100.050-0.05
300
400500600700
800
波长Wavelength/nm
200
0.50.40.30.20.10300
400500600700
800
波长Wavelength/nm
200
0.50.40.30.20.10300
400
500
600
波长Wavelength/nm
200
0.50.40.30.20.10300
400
500
600
波长Wavelength/nm
200
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350nm。

可见,芦丁在3种检测方法中都与沙棘黄酮有相同的吸收峰,波峰比较宽且平滑,因此,芦丁可以作为这3种检测方法的标准品。

2.2标准曲线的建立
3种检测方法的标准曲线分别为:NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法的回归方程A =0.0111C -0.0062,相关系数R 2为0.9931,试验浓度在0~50μg ·mL -1时存在良好的线性关系(图7);AlCl 3-CH 4O 显色法的回归方程A =0.0326x +0.0062,相关系数R 2为0.9995,试验浓度在0~18μg ·mL -1时存在良好的线性关系(图8);紫外分光光度法的回归方程A =0.0281C -0.0213,相关系数R 2为0.9955,试验浓度在0~25μg ·mL -1时存在良好的线性关系(图9)。

可见,芦丁作为标准品,3种检测方法的标准曲线在浓度范围内线性非常好,都可作为各种方法的检测用标准曲线。

2.3HPLC 法测分离沙棘汁黄酮与标准曲线建立由于沙棘中黄酮种类多,不确定哪一种标准品能够准确分离出,且能作为标准曲线用的标准品,试验中选择了3种标准品。

由图10可知,在此高效液相分离条件下,3种对照品能明显分离,无拖尾漂移现象。

根据单品的液相图保留时间,确定出图中标准品1为芦丁,保留时间为28.85min;2为槲皮素,保留时间为42.09min;3为异鼠李素,保留时间为48.19min。

又在此
液相条件下对沙棘总黄酮进行了组分分离,由图11可
知,此条件下分离出多个黄酮组分,图中标记1的峰的
保留时间为28.85min,波峰比较高,分离效果好,与图10对照品芦丁保留时间(28.85min)相同,可确定为芦
丁。

槲皮素在沙棘样品中出峰时间点附近有比较小的峰,但附近有多个峰,分离效果不理想。

异鼠李素在沙棘样品出峰时间点附近出现的波峰特别小。

可见,这3种黄酮苷元在沙棘中相对含量非常少,大部分的黄酮是黄酮的糖苷,含量明显高于黄酮苷元。

由于只有芦丁分离效果好,相对含量稍高,对应性强,故选择芦丁作为高效液相法的标准品。

以芦丁为标准品,建立高效液相法标准曲线的回归方程为y =37.933x +32.819,相关系数R 2为0.9999,试验浓度在0~160μg ·mL -1时存在良好的线性关系。

可见,芦丁作为标准品,分离效果好,曲线线性好,可以作为高效液相检测含量的标准品。

2.4样品测定
样品经处理后,采用不同方法测定总黄酮的含量,高效液相中总黄酮的浓度是将图12中黄酮的每个峰面积对应由标准曲线计算得到浓度相加,计算得出沙棘汁中总黄酮浓度为2.49mg ·mL -1,结果见表1。

由表1可知,不同的试验方法测定结果之间存在极显著差别(p <0.01),AlCl 3-CH 4O 显色法测出结果值过低,仅为
0.42mg ·mL -1,且样品不经过稀释,颜色较深而显色后测出的值又小,RSD 达到25%,误差较大;NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH
图7NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法标准曲线图
Figure 7The stand curve of NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH coloring method 图8AlCl 3-CH 4O 显色法标准曲线图Figure 8The stand curve of AlCl 3-CH 4O
coloring method
0.70.60.50.40.30.20.10
-0.1A =0.0111C -0.0062R 2=0.9931
10
20
30
40
50
60
0浓度Concentration/μg ·mL -1
0.80.60.40.20
-0.2
A =0.0326x +0.0062
R 2=0.9995
5
10
15
20
浓度Concentration/μg ·mL -1
图9紫外分光光度法标准曲线图Figure 9The stand curve of ultraviolet
spectrometry method A =0.0281C -0.0213R 2=0.9955
浓度Concentration/μg ·mL -1
0.80.60.40.20-0.2
5
10
15
20
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显色法所用试剂较多,显色后颜色差异较明显,测定结果的误差值仅为7%,相对较小,但测定值也偏小,仅为1.19mg ·mL -1。

采用紫外分光光度法测量的结果为2.47mg ·mL -1,与ECCLESTON 等[25]人报道的沙棘汁
中黄酮类的浓度结果相近,RSD 也仅为7%,误差较小。

以HPLC 法测得结果为标准,将这3种分光光度法与HPLC 法所测得结果做比较,结果见表2,发现紫外方法偏差率最小,仅为1%,其他两种方法偏差较大。

结合表1和表2结果,说明采用紫外方法所得到的数据较准确,所用试剂比较少,对环境影响也小,是最为理想的测定沙棘中总黄酮的方法。

表14种测定方法测定的沙棘样品总黄酮浓度
Table 1
The different concentrations of the flavonoid in sample by different methods
试验方法Experimental method
NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH coloration method AlCl 3-CH 4O 显色法AlCl 3-CH 4O coloration method 紫外分光光度法UV spectroscopy method
HPLC 法HPLC method
浓度Concentration/mg ·mL 1.190.42D 2.47B 2.49A
RSD/%7
2574注:A,B,C,D 代表极显著性差异(p <0.01)。

Note :A,B,C,D respect significant difference (p <0.01).
表23种分光光度法测定结果与HPLC 法相比的偏差率
Table 2Deviation rate between three kinds of spectrophotometric method and HPLC method
试验方法Experimental method
NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH coloration method AlCl 3-CH 4O 显色法AlCl 3-CH 4O coloration method 紫外分光光度法UV spectroscopy method
偏差率Deviation rate/%
52831
2.5加标后回收率比较
通过向测定样品中添加芦丁标准样品来检测样品的回收率,考查3种检测方法的准确性。

由表3、表4和表5中的数据结果可以看出,3种方法的回收率的平均值分别为97%,147%,99.6%,可以看出加标样后AlCl 3-CH 4O 显色法的回收率差异较大,比正常回收率值高47%;NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法的回收率稍低;紫外分光光度法的回收率达到99.6%,比较接近于100%,可见,紫外方法的回收率最好,对总黄酮含量变化反应灵敏,测得的数据比较准确,可以作为最为理想的沙棘总黄酮测定方法。

图10对照品HPLC 色谱图Figure 10HPLC chromatogram
of the references 图11沙棘汁中黄酮HPLC 色谱图
Figure 11HPLC chromatogram of flavonoids
in seabuckthorn juice
8006004002000
10
2030
40
50
保留时间Retention time/min
1
2
3
25002000
1500
10005000
10
2030
40
50
保留时间Retention time/min
1
2
3
图12HPLC 法标准曲线
Figure 12The stand curve of HPLC method
70006000500040003000200010000
-1000
50
100
150
200
浓度Concentration/μg ·mL -1
y =38.006x +24.858
R 2=0.9999
125
第50卷
沈阳
农业大学学报--
3讨论与结论
类黄酮化合物是一类具有重要药理活性的天然产物[26],其母核中含有碱性氧原子,一般带有酚羟基,本身在紫外光谱中有300~400nm 和240~280nm 两个吸收带组成,酚羟基与Al 3+产生黄色络合物,其吸收带会产生
明显红移,同时吸光度也大大增加[27]。

因此,可以选择铝配合物显色体系来测定总黄酮的含量。

本课题组通过沙棘汁以及标准品单体的高效液相色谱图比较可以发现,沙棘汁中游离黄酮苷元含量较少,大部分为黄酮糖苷,因而加入显色剂后,糖苷阻碍铝元素与羟基结合,造成黄酮不能正常显色,单波长测定时黄酮含量显现不出来,进而造成AlCl 3-CH 4O 显色法测定总黄酮含量浓度的偏小。

同时发现,NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法由于加入了强碱,可能在一定程度上水解糖苷键,水解出酚羟基可以再与Al 3+结合,所以采用此方法单波长测定结果升高,但是仍旧离高效液相验证值相差较大。

由于强碱与NaNO 2存在,吸收带产生更明显的红移,溶液能呈现红橙色,浓度对比结果比较直观。

但这种方法所用试剂比较多,操作繁琐,大部分试剂属于有毒有害的,所以也不建议采用此方法。

相对而言,沙棘汁样品经离心分离除杂,稀释后用紫外方法检测,其操作简单,在350nm 处采用单波长测定,杂质干扰不明显,用芦丁测试回收率,浓度反应灵敏,测定结果与高效液相验证值相差很小,是比较理想的沙棘汁总黄酮的测定方法。

沙棘汁中总黄酮测定方法中,NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法、AlCl 3-CH 4O 显色法与紫外检测法3种方法的最大吸收波长分别为510,420,350nm,芦丁在3种方法中的最大吸收波长与沙棘汁相同,可以作为这3种检测方法的标准品。

这3种方法的检测标准曲线相关系数R 2都在0.99以上,可见,芦丁作为标准品,3种检测方法的标准曲线在浓度范围内线性非常好,都可作为各种方法的检测用标准曲线。

试验中高效液相分离条件可明显分离芦丁、槲皮素、异鼠李素3种对照品,无拖尾漂移现象。

在此高效液相条件下沙棘汁总黄酮分离出多个黄酮组分,黄酮苷元在沙棘中相对含量非常少,大部分的黄酮是黄酮的糖苷。

芦丁分离效果好,相对含量稍高,对应性强,可作为高效液相法的标准品。

以芦丁为标准品,建立高效液相法标准曲线的相关系数R 2为0.9999,试验浓度在0~25μg ·mL -1时存在良好的线性关系。

NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法与AlCl 3-CH 4O 显色法测定值分别为1.19mg ·mL -1与0.42mg ·mL -1,与HPLC 对比,其准确性较低,且所用试剂比较多,操作繁琐因而不建议采用;
表3NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH 显色法的回收率
Table 3
Results of recovery rate experiment of NaNO 2-Al(NO 3)3-NaOH
编号Number 123
样品量/mL Sample amount
111
加芦丁量/mL Adding rutin amount
0.10.20.3
芦丁OD 值Rutin 0.1160.2170.313
未加芦丁OD 值Without rutin
0.1250.1250.125
加芦丁OD 值Adding rutin
0.2300.3510.425
回收率/%Recovery rate
91
10496平均回收率/%Average recovery rate
97
表4AlCl 3-CH 4O 显色法的回收率
Table 4Results of recovery rate experiment of AlCl 3-CH 4O
编号Number 123
样品量/mL Sample Amount
111
加芦丁量/mL Adding rutin amount
123
芦丁OD 值Rutin
0.0700.1350.210未加芦丁OD 值Without rutin
0.5510.5510.551
加芦丁OD 值Adding rutin
0.6260.7650.935
回收率/%Recovery rate
108150183
平均回收率/%Average recovery rate
147
表5紫外分光光度法回收率
Table 5Results of recovery rate experiment of ultraviolet spectrometry
编号Number 123
样品量/mL Sample Amount
111
加芦丁量/mL Adding rutin amount
123
芦丁OD 值Rutin
0.1030.2480.374未加芦丁OD 值Without rutin
0.6680.6680.668
加芦丁OD 值Adding rutin
0.7690.9281.027
回收率/%Recovery rate
98
10596平均回收率/%Average recovery rate
99.6
126
127
孙雪皎等院沙棘汁总黄酮测定方法的对比分析
第1期--紫外分光光度法操作简单便捷,测量值达到2.47mg·mL-1,准确性与HPLC结果(2.49mg·mL-1)相接近,回收率为99.6%,RSD为7%,因此,紫外分光光度法是沙棘汁总黄酮的理想测定方法。

本研究最终确立了一种快速简便的测定沙棘汁总黄酮的方法,这为沙棘中黄酮类物质更准确、更便捷的测定提供方法指导。

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[责任编辑李薇]。