菌种与种子扩大培养PPT教案

自发突变
传代增殖
➢ 防止衰纯种菌退的方法：合理不培纯养菌种条件，减少传代次数
➢ 复壮：分离单细胞，抗性筛选突，变个苛体刻条件
原始个体
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工业微生物菌种保藏技术
(1) 低温冷冻保藏； (2) 转接培养或斜面传代保藏； (3) 矿物油保藏； (4) 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 保藏原则：选择优良纯种、创造休眠环境 保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。一些细菌和
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冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华， 特点： ➢ 冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力 ➢ 冻干后的菌株可常温保存，便于运输 ➢ 必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等
种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。
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种子扩培的目的 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求： 总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，保持稳定的生产能力 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
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二，种子制备的过程：
石蜡油封藏法* 沙土保藏法
低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养
各大类 细菌、酵母菌
各大类** 产孢子微生物
3~6月 6~12月 1~2年 1~10年
简便 简便 简便 简便
冷冻干燥法
干燥、无氧、低 温、有保护剂
各大类
5~15年 以上
简便 、有
效
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、 种子扩大培养
种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状 态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶 或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量 和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含
碳水化合物的土壤（如一些野果生长区和
果园内）和沼泽地中，酵母和霉菌较多；
采样的对象也可以是植物或动植物残体，
腐败物品，霉菌较多；某些水域厌氧菌含
量较多。
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➢ 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为 好。
➢ 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除 去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清 洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采 样时间、地点、环境条件等，以备查考。采好的 样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下， 但贮存时间不宜过长。
➢ 生长和繁殖： 低等的(如诺卡氏菌)通过菌丝 断裂繁殖； 高等的(如链霉菌)在孢子丝成熟 后分化成许多孢子，孢子在适宜的环境中吸 收水分，膨胀、萌发，成为新的放线菌。
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2 放线菌(Actinomycetes)
➢ 工业上重要的放线菌 ➢ 龟裂链霉菌（土霉素） ➢ 金黄色链霉菌（金霉素） ➢ 灰色链霉素（链霉素） ➢ 红链霉菌（红霉素） ➢ 红小单胞菌（庆大霉素） ➢ 委内瑞拉链霉菌（氯霉素）
分离思路 ➢ 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照
生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
➢ 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
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新种分离与筛选的步骤
➢ 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的 生长培养特性。
➢ 采样：有针对性地采集样品。 ➢ 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使
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工业生产常用菌种
➢ 细菌 (Bacteria) ➢ 放线菌(Actinomycetes) ➢ 单细胞真菌 ---- 酵母(Yeast) ➢ 多细胞真菌 ---- 霉菌(Molds)
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1 细菌 (Bacteria)
➢ 形状和大小：单细胞微生物； 有球型、杆型和螺旋型； 典型直径0.5～1微米，长度～10微米；
菌种与种子扩大培养
一、工业微生物
菌种来源
从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物约为自 然界总数的1-5%，微生物的多样性仍然是以后若干年的 研究重点； 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。
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从自然界中分离菌种的一般过 程
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 不是病原菌，产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学 上最好与致病菌无关）
生产特性要符合工艺要求，培养条件易于控制，生 长迅速、发酵周期短
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防止菌种衰退
➢ 衰退的表现：所需产物的生产能力下降，营养物质代谢和生长繁殖能力下降 ➢ 衰退的原因： ➢ 内因：基因突变，变异菌株性状分离 ➢ 外因：菌种保藏不妥；菌种的生长条件要求没有得到满足；或遇到不利的条
➢
展开青霉—灰黄霉素
➢ 根霉属: 米根霉 — 制曲、乳酸
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一些常用工业微生物
抗生素生产有关的微生物
放线菌（链霉素四 环素；红霉素等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
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氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
❖ 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照 射后的处理应在红灯下进行。
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操作步骤 1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液， 将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。
2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手 摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤， 单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞 数可达107 -108个／ml左右，作为待处理菌悬液。 3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一 无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下 30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外 灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作 均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。
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增殖培养
➢ 就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生 长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标 菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。
➢ 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤 维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
➢
无性繁殖是主要方式，生长中，菌丝伸长和分支，从
菌丝体顶端形成新的孢子，继而形成细胞。 新细胞具有菌
龄，典型的倍增时间为4～8小时；
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4 多细胞真菌 ---- 霉菌(Molds)
➢ 工业上重要的霉菌
➢ 曲霉属: 黑曲霉—淀粉酶、蛋白酶、柠檬酸
➢
和葡萄糖酸
➢
米曲霉—酱油
➢ 青霉属: 产黄青霉—青霉素
所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 ➢ 分离：利用分离技术得到纯种。 ➢ 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特
性包括形态、培养特征、营养要求、生理生 化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受 最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、 提取工艺等。
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1、采样对象
采样
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过
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纯种分离
➢ 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。 因此还必须分离，纯化。
➢ 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
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性能测定
➢ 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的 容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。
➢ 这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用 人工育种方法得到的变异菌株。
在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过 高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。
步骤：
突变 基因突变库的建立
筛选 基因突变库的筛选
基因复制与遗传
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业微生物的要求能够利用廉价的原料，简来自的培养基，大量高效地合成 产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强
实验室种子制备阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、 摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌 种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。
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4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.1ml进 行稀释分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三 角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养 4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行检测。
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基因的直接进化育种
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➢ 传代保藏：斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存 ➢ 矿物油保藏：将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保 ➢ 载体保藏：麦壳，砂土灭菌后可用作载体
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几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
主要措施 适宜菌种 保藏期 评价
冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体）
➢ 卡那链霉菌（卡那霉素）
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3 单细胞真菌 ---- 酵母(Yeast)
➢ 形状和大小：单细胞，卵圆形，圆形或圆柱形；比细菌大， 直径约1～5微米，长约5～30微米。
➢ 生长与繁殖：酵母分有性和无性繁殖，以无性繁殖为主。 无性繁殖分为芽殖和裂殖，以芽殖为主。
❖ 工业上重要的酵母菌
❖
➢ 繁殖方式：裂殖，倍增时间25～ 45分钟。 ➢ 工业上重要的细菌： G+：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、北
京棒杆菌等。G-： 醋酸杆菌、大肠杆菌。 ➢ 产品：淀粉酶制剂，乳酸，乙酸，氨基酸等
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2 放线菌(Actinomycetes)
➢ 形状和大小：细胞呈长丝状，菌落呈放线状， 介于细菌和真菌之间，菌丝直径0.2～1.2微 米，与杆菌接近；
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诱变剂
物理诱变剂：射线如紫外线、 X-射线、γ-射线，快中子；
生物诱变剂：噬菌体、转座子
化学诱变剂：化学因子如碱基 类似物、5-第氟20页/共尿63页嘧啶、烷化剂 等。
诱变育种步骤
•出发菌株的选择 •菌悬液的制备 •前培养 •诱变处理 •变异菌株的分离和筛选
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例
啤酒酵母(酒精、啤酒等)
❖
。
假丝酵母(单细胞蛋白、柠檬酸、脂肪酸、石油脱蜡)
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4 多细胞真菌 ---- 霉菌(Molds)
➢ 形状和大小：分支状，菌丝体盘结交错，形成浓密菌落，使 发酵液粘稠。比放线菌大，直径3～10μm
➢ 生长与繁殖：
➢
片段菌丝可以生长成新的菌丝体；
➢
有性和无性方式，产生孢子进行繁殖；
紫外线的诱变育种
➢ 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为
2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时 间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们 常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控 制在70～80%为宜。 ❖ 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右， 霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外 线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～ 1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌， 使照射均匀。
保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代
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冷冻保藏：-20℃以下冷冻，使微生物代谢活动停止 分类：普通冷冻保藏(-20℃)
超低温冷冻保藏(-60一-80℃) 液氮冷冻保藏(-156℃)
特点：简单有效 培养物运输较困难
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在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
和地衣芽孢杆菌
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诱变育种
➢ 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率 并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6~10-10 左右。
➢ 诱变育种： 利用各种物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提 高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所 需要的高产优质菌种的育种方法。
➢ 诱发突变的育种，是迄今为止国内外提高菌种产 量、性能的主要手段。
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
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食品工业微生物
包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌