基因工程试卷2

华中农业大学本科课程考试评分标准
考试课程与试卷类型：基因操作原理姓名：
学年学期：学号：
考试时间：班级：
一、填空题（每小题2分，共30分）
1.PCR技术应用广泛，以下不属于PCR应用的为 ___D_____：(A) 随机扩增多态性
DNA(RAPD)； (B) 扩增片段长度多态性(AFLP)； (C) RACE； (D) S1 酶作图。

2.λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个____12_____个碱基组成的天然黏性末端。

3.PCR扩增有时会出现弥散的条带，以下原因阐述不正确的是___B______：(A) 退火温度
过低； (B) 退火温度过高； (C) dNTP 浓度过高； (D) 循环次数过多。

4.下列哪一种酶作用时需要引物____B_____：(A) 末端转移酶； (B) 反转录酶；(C) DNA
连接酶； (D) 限制酶。

5.Cosmid 实际上是由_λ噬菌体__和__质粒_____构成的杂合载体，也可以说是带有__cos__
序列的质粒。

6.限制性内切酶的命名主要根据__来源菌株属名第一个字母，种名头两个字母以及菌株号、
序号_____来确定，以下各种书写方式中哪种或哪几种是正确的____AC____：(A) Pst I;
(B) KpnI； (C) Hin dIII; (D) Hind III; (E) T th111I; (F) Bsp1286I； (G) XbaI
7.在分子克隆常用的E.coli菌株中Dam 和Dcm 甲基化酶都是有活性的，它们可在DNA
的特定位点作甲基化修饰。

而许多限制性内切酶对甲基化是敏感的，一旦所识别的酶切位点被甲基化就不能切割该位点，如Cla I (AT/CGAT)。

请问Cla I不能切割以下哪个或哪些来自dam+ dcm+ E.coli菌株的DNA序列____C_____。

(A) ATCGATA； (B) ATCGATG；
(C) ATCGATC； (D) ATCGATT。

8.限制性内切酶有其特定的识别位点，如Eco RI 的识别位点为 ___GAATTC___；有些限制
性内切酶切割DNA后可产生带有相同末端的DNA产物，这些酶称为同尾酶，例如__Bam HI__限制性内切酶与___Sau3AI_________限制性内切酶切割DNA形成的末端相同。

（任举一例都可以）
9.在基因操作过程中会使用一些多对人体有害的物质, 操作时应小心谨慎, 常用的有害物
质有UV light、DEPC、____EB___和____苯酚____等。

（任举一例都可以）
10.根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。

在下列文库中_C_是
cDNA文库。

(A) YAC文库； (B) PAC文库； (C) 扣减文库； (D) BAC文库。

11.M13KO7是一种辅助噬菌体，可用它帮助噬菌粒制备单链DNA，这是因为以下原因_B_：
(A) M13KO7能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体DNA； (B) M13KO7能够提供
成熟包装的蛋白； (C) M13KO7提供了成熟包装所需的信号； (D) M13KO7的10个基因都是正常的。

12.在制作DNA嵌套缺失突变体时主要有3种方法，其核心技术都使用了一种核酸酶，它们
分别是__外切核酸酶III__、__BAL31__和___DNaseI___。

13.在核酸杂交过程中，一般都要先做预杂交，这是为了__B__：(A) 做预备试验，寻找最佳
反应条件； (B) 封闭背景； (C) 使杂交信号更强； (D) 减少非特异性杂交信号。

14.在许多克隆载体中都使用了 -互补机制来做筛选标记，也就是俗称的“蓝白菌落”筛选，在
应用过程中使用了两种引起颜色变化的试剂，它们是___x-gal__和____IPTG__。

15.在基因操作中有些不同的名称具有相同的缩写，例如RT-PCR, 可以是___实时定量PCR__
或___反转录PCR___的缩写。

二、名词解释（每小题3分，共21分）
1．Star Activity (in restriction enzymes)
星星活性，（1’）
极端非标准条件下，限制性内切酶切割与识别序列相似的序列，这个改变的俄特殊性称星星活性。

（2’）
2．Northern blotting
Northern 杂交，（1’）
即DNA与RNA的杂交，与Northern杂交的不同之处在于转移的是RNA而不是DNA。

（1’）
Northern 杂交是转录水平的检测，用于检测样品中是否有与探针同源的mRNA分子。

（1’）3．Shuttle vector
穿梭载体，（1’）
能够在两类不同的宿主中复制、选择和增殖的载体。

（2’）
4．Chromosome Walking
染色体步查，（1’）
采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探针，以鉴定含有相邻序列的重组克隆的方法称染色体步查。

（2’）
5．Klenow fragment
Klenow片段，（1’）
大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶水解的大片段。

（1’）
具有5’—3’聚合和3’—5’外切活性。

（1’）
6．Universal primer
通用引物，（1’）
参照载体上多克隆位点两侧的一段固定DNA序列设计的引物，（1’）
用于分析插入片段的序列。

（1’）
7．Competent cells
感受态细胞，（1’）
能够吸收外源DNA的细胞称作感受态细胞。

（2’）
三、分析简答题（每小题5分，共25分）
1. 人类基因组的大小约为3000Mb，测序方法有两种，即图谱测序法和全基因组鸟枪法。

这
两种测序结果和分析于2001年分别发表在《Nature》和《Science》杂志上。

在第一种方法中，首先将靶基因组部分酶切产生大分子DNA片段，经电泳分离纯化克隆到BAC载体中。

根据分子标记和指纹图谱构建BAC克隆重叠群，挑选单个克隆采取鸟枪法测序。

在每个BAC克隆内根据测序结果进行顺序拼接，并与BAC克隆重叠群物理图谱对比，完成全部主体顺序的组装(The International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001, 409: 860~921)。

假如你是测序工作组中的一员，由你负责某个BAC克隆子中约100kb的序列测定，该如何实施？
①分离纯化该质粒，构建外源DNA片段大小2-5kb的亚文库。

（1’）
②用构建亚文库的载体上的通用引物作大规模末端测序。

（1’）
③测序的各reads 拼接，得到contig。

（1’）
④借助PCR等手段，填补contig中的gap。

（1’）
⑤通过酶切图谱验证测序结果。

（1’）
体是常用的一种。

A/T载体也有多种工作方
式，下图是pCR2.1-TOPO 载体的核心工作原
理示意图。

请说出A/T载体克隆PCR产物的
一般原理，以及pCR2.1-TOPO 载体所拥有的
特殊工作方式。

①用不具有3’-5’外切活性的高温DNA polymerase（如Taq）作PCR扩增时，其产物3’
多一个碱基A。

（1’）
②在A/T载体的3’未端各有一个突出的碱基T，用于和A配对，从而克隆Taq polymerase
的PCR产物。

（2’）
③Topoisomerase第274位的酪氨酸与DNA 5’端磷酸之间形成的磷酸二酯键是不稳定的，
容易受到DNA 3’羟基的攻击。

TOPO 载体利用其末端自身携带的Topoisomerase形成磷脂键，不需要外加连接酶。

（2’）
3. 从苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中克隆得到一个质粒pBMB175，选用限制性内
切酶Cla I和Xba I对该质粒进行酶切分析，得到以下如表所示的结果。

请根据所得的酶切片段大小，标出Cla I酶切位点在质粒pBMB175上的位置。

Xba
限制片段的大小（kb）
片段
序号ClaⅠ XbaⅠ Cla I+Xba I
1 11.0 8.8 7.6
2 4.2 5.4 3.0
3 1.0 2.4
4 1.2
5 1.0
总计15.2 15.2 15.2
3.0kb 和1
4.0 kb ，答对一处给2分
4．许多限制性内切酶切割DNA 后可产生相同的突出末端，这些产物彼此之间可进行粘端连接。

但在连接产物中相应位置的酶切位点就不存在了。

例如某DNA 片段用Cla I (AT/CGAT)酶切后，可与Acc I (GT/CGAC)切割的载体连接，但在连接点处的Cla I 和Acc I 位点都消失了，相应的序列变成了ATCGAC 。

下图最上面的序列为Cla I/ Acc I 连接处的DNA 序列。

通过这些步骤可在连接点处恢复Cla I 位点，请指出每一步所用的关键酶和底物。

1.Sph I
2.Klenow （或T 4 T 7 polymerase ）
3.过量dATP
4.S1酶（或绿豆核酸酶）
5.ligase 每空一分
Recovering Cla I
--ATCGA
CAAGCTT----TAGCTGGCC AA----ATCGA TT-- --TAGCT AA----ATCGATT-- --TAGCTAA--
--ATCGA CCGGCATGCAAGCTT----TAGCT GGCCGTACGTTCGAA----ATCGACCGGCATG CAAGCTT----TAGCTGGCC GTACGTTCGAA--D ( 5 )
C ( 4 )
B ( 2 ， 3 )
A( 1 )
5. 用于cDNA 克隆的方法很多,下图是 SMART 技术构建全长cDNA 文库的基本原理流程图。

请叙述其核心步骤。

①polyT 引物合成cDNA 第一链，反转录酶具有末端转移酶活性，自动在产物末端加上几个d （C ）。

（2’）
②反转录过程中同时添加了带有3个d （G ）的引物，以该引物合成第一链的互补链，锚定全长cDNA 。

（2’）
③引物延伸或长距离PCR 得到双链cDNA 。

（1’）
四、问答题 （每小题8分，共24分）
1. 通过生物测定，发现一种真菌具有抗某种细菌的抗菌活性。

通过生物化学的方法从该真
菌中分离到一个具有抗细菌活性的蛋白质，该蛋白表现出良好的开发成蛋白药物的潜力。

若要在E.coli 或酵母菌中大量表达并制备该抗菌蛋白质，试问如何分离得到该蛋白的编码基因。

①测定该蛋白质的N 未端氨基酸序列（1’）
②根据氨基酸序列设计简并引物，用作基因克隆的探针（2’） ③构建真菌的cDNA 文库（2’）
④用探针作Southern 杂交，从文库中筛选含该基因的重组子（2’） ⑤重组子的纯化、验证测序（1’）
①中如果是制备该蛋白的抗体
③构建表达文库，从中筛选则该题亦可给分。

2. 魔芋 (Amorphophallus ) 是单子叶植物纲 (Monocotyledoeae )、泽泻目 (Alismatales )、天南
星科 (Areaceae ) 的多年生草本块茎植物。

在中国广泛种植的种是花魔芋。

魔芋块茎的主
Poly A +RNA
经过修饰的oligo(dT)引物
合成第一链并通过RT 加上(dC)尾巴
SMART II 或SMART IV 寡核苷酸
转换模板并在反转录酶的作用下延伸
引物延伸或通过LD-PCR
高质量的双链cDNA
要成分是葡甘聚糖，可广泛应用于食品、医疗、化工、造纸、纺织和石油等行业，是一种商业价值比较高的经济作物。

目前魔芋产业发展面临的最大难题在于其种植上的软腐病害，该病害可造成魔芋产量的严重损失，甚至绝收。

然而，软腐病害目前尚无有效的防治措施。

魔芋软腐病是由胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜致病变种(Erwinia carotovora pv. carotovora) 引起的，利用基因工程技术将抗欧文氏杆菌的基因转入魔芋，使魔芋具有抗病特性，是解决魔芋病害的有效措施之一。

现已将抗病基因――高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)，转入魔芋并获得幼苗，经标记检测和斑点杂交检测，证实目标基因已经导入。

下一步将检测目标基因是否表达，请问可在哪几种水平上进行检测，如何实施。

①转录水平检测：（4’）
通过Northern blotting检测目标基因是否转录产生mRNA。

提取转基因魔芋植株的总RNA，电泳、转膜。

利用目标基因制备探针。

探针与膜杂交检测目标基因是否转录。

如果答通过实时定量PCR检测，也可以给分。

②翻译水平检测：（4’）
通过Western blotting检测目标基因是否表达产生蛋白。

提取转基因植株的总蛋白，电泳、转膜。

体外表达aiiA基因，纯化蛋白，免疫动物制备抗体。

抗体与膜杂交，检测目标基因是否表达。

③表型检测：（不作要求）
用胡萝卜软腐欧文氏杆菌侵染转基因植株，同时设置非转基因植株作为对照，检测转基因植株的抗病能力从而判断目标基因是否表达。

3.枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 是一种革兰氏阳性细菌，可产生多种多样的酶，常用于生
产工业、食品和医用酶制剂。

现发现一株枯草芽胞杆菌产生一种有价值的酶，但其表达量很低。

如果想在枯草芽胞杆菌中高表达这种酶，则需要一个高表达的启动子。

请设计一种载体及相应的实验方案，从枯草芽胞杆菌中克隆高表达的启动子。

①构建一个大肠杆菌和芽胞杆菌的穿梭载体，其必须元件包括：大肠杆菌复制子，大肠
杆菌筛选标记（如Amp R），芽胞杆菌复制子，芽胞杆菌筛选标记（如Erm R），多克隆位点（2’）
②多克隆位点后面紧跟一个报告基因（如绿色荧光蛋白基因，抗性基因等）。

该报告基因
没有启动子，只有ORF。

（2’）
③以该载体构建出发菌株的基因组文库。

（2’）
④分离文库重组子中的质粒，转化枯草芽胞杆菌，筛选报告基因表达的转化子，则该转
化子装载的外源片段就包含启动子。

（2’）。