酸性磷酸酶的显示方法

四、实验操作
④30min后，将玻片转入10％中性福尔马林，4℃冰箱内 固定30min。 ⑤自来水漂洗5min，把水沥干。 ⑥转入酸性磷酸酶作用液中，37℃处理30min。 ⑦自来水漂洗片刻。 ⑧1％硫化胺处理3～5 min。 ⑨自来水冲洗，甩干。
四、实验操作
⑩用1：30的姬姆萨染液染色15min。 ⑾自来水冲去染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜检。 ⑿对照实验 ⒀将第3步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min，使酶失 活，再进行⑥～ ⑾步的的基本原理和方法。 观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。
二、实验原理
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基，在pH5.0 的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因 其是无色的，所以再经过与硫化铵作用，形成棕黑 色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性璃酸酶在细胞 内的存在与分布。
实验八
酸性磷酸酶的显示方法
实验简介
酸性磷酸酶是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨噬细胞中。在 正常情况下，巨噬细胞牌休止状态，酶活性很低，但在一定的
pH条件下，其酶活性可被激活。本实验预先用6％淀粉肉汤腹腔 注射以激活小鼠腹腔巨噬细胞，使酸性磷酸酶能分解磷酸脂而
释放磷酸基，在pH5.0时，磷酸基能与铅盐形成磷酸铅，然后经 与硫化铵作用而形成棕黑色的硫化铅沉淀。在显微镜下可见小 鼠腹腔巨噬细胞为不规则形状，阳性细胞内有大小不等的棕色 或棕黑色的颗粒，即为酸性磷酸酶。 实验学时3个。
五、实验结果
在巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗 粒和班块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富，整个 细胞质区域都有黑色沉淀。 中性粒细胞呈现阴性反应。
六、作
业
简述酸性磷酸酶显色的原理是什么？ 绘制一张实验所见的巨噬细胞中酸性磷酸酶显色图。
谢谢观看！
三、实验用品
1、材料 小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞) 2、器材 高压灭菌锅、冰箱、注射器、载玻片、盖玻片、显微 镜、恒温水浴锅、擦镜纸。 3、试剂 ① 10％中性福尔马林(pH6.8～7.2) 甲醛 10ml 醋酸钠 2g ② 酸性磷酸酶作用液 蒸馏水 90ml 0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml 5％硝酸铅 2ml 蒸馏水 90ml
⑤姬姆萨染液(1：30) 姬姆萨原液 3滴
磷酸盐缓冲液(PH6.8) 5ml ⑥3％淀粉肉汤 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 0.3g 1.0g 0.5g 100ml
高压灭菌9.9×104Pa(15磅)20min，再加入可溶性淀粉 6g，60～80℃水浴溶解后，4℃冰箱保存备用。
四、实验操作
①取小白鼠1只、每日腹腔注射6％淀粉肉汤1m1，连续注 射3天。 ②第3天注射后3～4h，脱颈处死小鼠，打开腹部皮肤，暴 露腹膜，再向腹腔内注射生理盐水2ml，过3min后在原注 射部位抽取腹腔液0.1～0.2ml。 ③将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每片1～2滴。将玻片垂 直插入玻片架，迅速放到冰箱内(4℃)，让细胞自行铺展。
③ 2%β-甘油磷酸钠
4ml
先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两 份，一份中加醋酸铅溶液，另—份加甘油磷酸钠溶液， 然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。若pH＜5.0， 可加少量醋酸调节。临用前配制。配好后的作用液应透 明无絮状悬浮物和沉淀，否则将严重影响实验结果。 ④ 1％硫胺溶液 硫化胺 蒸溜水 1ml 9ml
二、实验原理
本实验的技术特点是： ①用冷冻涂片和中性福尔马林固定，可避免在固定、包埋及制 片过程中酶的失活，保证了实验的稳定性。 ②采用较短的作用时间，可避免细胞质内其它蛋白质及核内出 现阳性假象，保证了实验的可靠性。 ③以姬姆萨染色的巨噬细胞为观察对象，细胞核及细胞轮廓以 及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰，有助于深入理解细胞 吞噬作用、浴酶体功能和分布以及溶酶体标志酶—酸性磷酸酶 的性质。