甘草黄酮抑制脂多糖诱导的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达

·论
著·
甘草黄酮抑制脂多糖诱导的小胶质细胞
诱导型一氧化氮合酶表达
陈浩张皓洁师亮李滢昊任衍康景玮王燕宏李新毅
DOI ：10.11655/zgywylc2019.06.001
基金项目：国家自然科学基金（81173455）
；山西省自然科学基金（2015021189）；山西医科大学博士启动基金（03201410）；山西医科大学基础医学科技培植基金（201423）；山西医科大学大学生创新创业基金（20172098）
作者单位：030032太原，山西医科大学附属大医院山西医学科学院神经内科（陈浩、景玮、王燕宏、李新毅）；山西医科大学基础医学院（张皓洁、师亮、李滢昊、任衍康）
通信作者：李新毅，Email ：57411459@
帕金森病（Parkinson′s disease ，PD ）
以中脑黑质多巴胺能神经元进行性和选择性减少为特征，机制未明。

与其他神经元相比，多巴胺能神经元对炎症更敏感；黑质恰是脑内炎症效应细胞——
—小胶质细胞分布最为密集的脑区［1］。

大量PD 患者研究、动物
模型及实验治疗研究均证实小胶质细胞活化诱发的
神经炎症参与PD 发生发展过程［2］。

诱导型一氧化氮
合酶（inducible nitric oxide ，iNOS ）
是炎症过程中重要的调控蛋白，同时iNOS 还与多巴胺能神经元丢
失密切相关［
3，4］。

我们前期研究［5］
和其他团队最新研究
［6］
表明甘草主要组分———甘草黄酮（g labridin ，
Gla ）能减轻PD 小鼠黑质多巴胺能神经元缺失，
但其机制并未阐明。

甘草或Gla 对小胶质细胞活化及
iNOS 表达的影响也鲜见报道。

本研究旨在排除体内因素干扰，观察Gla 对PD 造模剂脂多糖（lipopolysaccharide ，LPS ）诱导的小胶质细胞活化影响，以期为PD 的临床治疗提供新思路。

1材料与方法1.1
实验材料
小鼠BV ⁃2小胶质细胞株购于上海容创生物公
Glabridin inhibits LPS ⁃induced iNOS expression in microglial cells Chen Hao *,Zhang Haojie,Shi Liang,Li
Yinghao,Ren Yankang,Jing Wei,Wang Yanhong,Li Xinyi.*Department of Neurology,Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University,Shanxi Academy of Medical Sciences,Taiyuan 030026,China
【Abstract 】Objective To investigate the effects of glabridin (Gla)on NO production and iNOS expression in BV ⁃2microglial cells.Methods BV ⁃2cells were divided into the control group,LPS group and Gla treatment group and processed accordingly.The NO release was detected by NO kit,the expression of iNOS mRNA by RT ⁃PCR,and the expression of iNOS protein by immunofluorescence staining.Results LPS stimulation significantly increased NO release and iNOS mRNA production in BV ⁃2microglial cells (P <0.01),resulting in a large number of iNOS ⁃positive cells,larger cell size,thicker and shorter cell protrusions.Gla treatment significantly reduced NO release and iNOS mRNA production in BV ⁃2cells (P <0.01),significantly fewer iNOS ⁃positive cells,smaller cell size,and slim cell pro ⁃trusions.Conclusion Gla may regulate the iNOS expression in BV ⁃2cells and inhibit the neuroinflammation induced by LPS in microglial cells
【Key words 】Glycyrrhiza uralensis ;Flavones ;Lipopolysaccharide ;Microglial ;I nducible nitric oxide
【摘
要】目的
探究甘草黄酮（Gla ）对脂多糖（LPS ）诱导的BV⁃2小胶质细胞一氧化碳（NO ）
生成和诱导型一氧化氮合酶（iNOS ）表达影响。

方法将BV⁃2细胞分为对照组、LPS 组和Gla 处理组，
并进行相应处理。

采用NO 试剂盒检测NO 释放量；转录聚合酶链反应（RT⁃PCR ）法检测iNOS mRNA 表达量；免疫荧光染色显示iNOS 蛋白在BV⁃2细胞表达情况。

结果
LPS 刺激可显著增加BV⁃2小胶质细胞NO 释放量和iNOS mRNA 生成量（P <
0.01）
，造成大量i⁃NOS 阳性细胞出现，细胞体积增大，突起变粗短。

Gla 处理则可显著降低BV⁃2细胞NO 释放量和iNOS mRNA 生成量（P <0.01）
，同时iNOS 阳性细胞数明显减少，细胞体积缩小，突起变细长。

结论Gla 可调节BV⁃2细胞i⁃NOS 表达，抑制LPS 诱导的小胶质细胞神经炎症。

【关键词】甘草；黄酮类；脂多糖；小神经胶质细胞；诱导型一氧化氮合酶
司，Gla购于中国食品药品检验研究院，LPS购自美国Sigma公司，杜尔伯科极限必需培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司，NO化学法试剂盒购自南京建成生物公司，兔抗iNOS单克隆抗体购自加拿大Neomark⁃ers公司，羊抗兔IgG⁃异硫氰酸荧光素（FITC）购于武汉博士德生物公司，Trizol试剂盒和逆转录试剂盒购于美国Thermo公司。

1.2实验方法
1.2.1细胞培养和分组处理：将BV⁃2细胞置于DMEM培养基37℃、5%CO2培养箱进行传代培养。

取对数生长期的细胞，调浓度为4×105个/m l，接种于24孔板及细胞爬片，加培养基继续培养3d后分组：对照组（无药物处理）、LPS组（1.0μg/m l LPS处理12h）和Gla处理组（分别用相对安全的3μg/m l 和5μg/m l浓度Gla［7］预处理2h，再经1.0μg/m l LPS处理12h）。

1.2.2细胞培养上清液NO含量测定：按上述分组处理完成后，收集各组培养基上清液，采用Griess法检测NO含量。

按照NO化学法试剂盒说明书操作，最后用酶标仪测定540nm处的吸光度（A）值。

对照标准曲线，计算NO含量。

1.2.3反转录聚合酶链反应（RT⁃PCR）：按上述分组处理完成后，收集各组细胞。

采用Trizol试剂盒提取RNA，并用蛋白核酸分析仪进行浓度测定。

取2μg 总RNA逆转录成cDNA。

引物由Primer5.0软件设计，并由北京赛百盛公司合成。

iNOS正向引物：5′⁃AACATCAGGTCGGCCATCAC⁃3′，反向引物：3′⁃CCAGAGCCTGAAGTCATGTTTG⁃5′，产物大小为66 bp。

内参照甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（GAPDH）正向引物：5′⁃ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA⁃3′，反向引物：3′⁃ATGCCTGCTTCACCACCTTCT⁃5′，产物大小为81 bp。

反应体系内含10×PCR缓冲液2.5μl，10μmol/L 正向及反向引物各1μl，cDNA2μl，2.5mmol/L dNTPs1μl，5U/ml Taq DNA聚合酶0.25μl，无菌双蒸水补充体系至25μl。

反应条件为95℃预变性3min，然后95℃变性5s，60℃退火35s，72℃延伸30s，扩增40个循环，最后72℃延伸10min。

扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并拍照记录行图像分析。

用目的基因与内参照的吸光度之比作为目的基因mRNA相对表达水平。

1.2.4免疫荧光染色：待细胞爬片培养完成后，用4%多聚甲醛固定，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗；再用胎牛血清封闭40min，倾去勿洗；滴加兔抗iNOS单克隆抗体（1∶500），4℃过夜；再加羊抗兔IgG⁃FITC（1∶150），室温孵育1h，PBS冲洗；DAPI复染，甘油封片，荧光显微镜下观察照相。

1.3统计学处理
采用SPSS16.0统计软件，所有实验数据用x±s 表示，进行单因素方差分析和LSD⁃t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1BV⁃2细胞NO生成检测：经Griess法试剂盒检测发现：与对照组相比，LPS刺激可显著增加BV⁃2细胞培养液中NO浓度（P<0.01）；与LPS组相比，3μg/m l和5μg/m l Gla处理后均可明显抑制LPS诱导的BV⁃2细胞NO释放（P<0.01），但2个浓度组之间差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2BV⁃2细胞iNOS mRNA表达检测：与对照组相比，LPS刺激可显著增加BV⁃2细胞内iNOS mRNA 表达量（P<0.01）；而经3μg/m l和5μg/m l Gla处理后均可显著抑制LPS诱导的iNOS mRNA表达（P< 0.01），但2个浓度组之间差异无统计学意义（P> 0.05），见表1。

2.3BV⁃2细胞iNOS免疫荧光染色结果：对照组较少有iNOS阳性细胞，细胞体积较小，突起细长；被LPS刺激后，大量BV⁃2细胞呈iNOS阳性，定位于细胞胞体和突起，同时细胞体积增大，突起变粗短；经2种不同浓度Gla处理后，与LPS组相比，表达iNOS的BV⁃2细胞均明显减少，同时细胞体积变小，突起恢复细长。

3讨论
造模剂LPS通过诱发一系列免疫炎症和神经毒性因子造成神经退行性变，常被用以制作PD细胞或动物模型［8］。

我们用LPS直接作用于体外培养的BV⁃2小胶质细胞，发现培养液中产生大量NO。

NO不但是炎症产物，还是PD发病过程中重要的信号分子，可多途径导致多巴胺能神经元死亡［4］。

iNOS
2.81±0.120.08±0.01
14.15±1.32a0.57±0.06a
6.58±0.52b0.26±0.04b
5.74±0.87b0.19±0.03b
注：a与对照组比较P<0.01；b与LPS组比较P<0.01
培养液NO浓度
（μmol/L）
iNOS mRNA表达量
（目的基因与内参光
密度比值）表1Gla对BV⁃2细胞NO生成和iNOS表达影响（x±s）
对照组6
LPS组6
3μg/m l Gla处理组6
5μg/m l Gla处理组6
组别例数
是NO生成过程中最为关键的限速酶。

为探寻培养液中NO来源，我们对iNOS表达进行定量和定位分析，结果发现经LPS刺激后BV⁃2小胶质细胞内产生大量iNOS mRNA；进一步进行iNOS免疫荧光染色，结果显示经LPS刺激后出现大量iNOS阳性
BV⁃2细胞，iNOS表达于BV⁃2小胶质细胞胞质；同时我们也注意到经过LPS刺激BV⁃2细胞体积增大，突起减少变粗。

提示LPS刺激使BV⁃2小胶质细胞活化并分泌iNOS等促炎因子，导致NO等炎症产物产生。

而小胶质细胞促发的脑内炎症，最终将导致多巴胺能神经元丢失。

体内研究也支持上述结论［9，10］。

Gla是甘草所含两大组分中最具生物活性的一种，近年来Gla被报道在改善急性及慢性肺炎、肠炎、心血管炎症等方面表现出很好调控效果［11，12］。

将小鼠单核巨噬细胞用甘草提取物处理，可抑制其分泌促炎细胞因子［13］。

鉴于炎症与PD发病的密切关系，我们研究了Gla对脑内炎症始动细胞小胶质细胞的影响。

首先我们根据文献［7］选取对细胞无毒性且相对安全的中、低浓度Gla，然后用其预处理体外培养的BV⁃2小胶质细胞，再经LPS刺激后，发现与单纯LPS组相比，Gla处理组培养液NO含量显著降低，提示Gla对LPS诱发的小胶质细胞炎症也有潜在抑制作用。

进一步观察iNOS表达情况，结果发现经Gla处理后BV⁃2细胞内iNOS mRNA生成显著减少，iNOS阳性的BV⁃2细胞也明显减少，同时细胞体积缩小，突起变细。

提示Gla通过对iNOS表达的调节，减少小胶质细胞活化，抑制炎症因子分泌。

综上所述，Gla可调节小胶质细胞iNOS基因表达，影响炎症产物生成和小胶质细胞活化，对抗LPS 毒性。

本研究结果可能提示Gla不但可减少PD发病过程中多巴胺能神经元的丢失，还具有改善脑内的炎症状态的潜质。

对此尚需要进一步进行动物和临床实验研究证实。

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（收稿日期：2018⁃09⁃13）。