第八章 植物细胞培养及次生物质生产

物中，培养液呈流动状态，进行无菌
培养的一种技术。
固定化培养的优点p95：
细胞生长较缓慢，有利于次生代谢物的积 累； 易于控制培养系统的理化环境和收集产物； 包埋后细胞受到的剪切力损伤减少；
有利于进行连续培养和生物转化；
固定化细胞培养的条件
• 选用固定化细胞培养应具有如下两个条件：
–目的产物应自然分泌到培养液中，或者通过改 变PH值、离子强度或使用渗透剂使之分泌于培 养基中； –要求产物的形成在细胞生长之后。
细胞固定化方法
• 常用的包埋固定方法：
• （1）海藻酸盐固定化
• • 滴入CaCl2使海藻酸盐形成颗粒 滴入NaCl使卡拉胶形成颗粒
• （2）卡拉胶固定化 • （3）琼脂糖固定化
• （4）琼脂固定化
常见的几种植物固定化生物反应器系统
（ b）
• ① 流化床生物反应器：
空气出口
• 细胞包裹在胶粒、金属或泡 沫颗粒中。 • 优点：细胞包埋颗粒小，传 质效率高。 • 缺点：剪切力或碰撞破坏细 胞。
细胞株（Cell Strain)
• 细胞系(Cell line)：经继代培养纯化，获得 的以一种细胞为主的能在体外长期生存的 不均一的细胞群体。 • 细胞株(Cell strain)：从一个经过生物学鉴定 的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的 方法由单胞系增殖形成的、生长速度快、 目标产物含量高、适宜于大规模培养的均 一的细胞群体 。
二、植物细胞培养生产代谢产物的 意义
• 提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部 位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有 所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。 一般含量为0.005% 左右。生产1kg紫杉醇需要砍 伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫 杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。破坏 宝贵资源、不可持续发展。
– 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下 对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变 体筛选的常用方法。 – 由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便 等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理 生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。 • 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害 或影响组织吸收。
2、看护培养
(一)愈伤组织的诱导
外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细 小颗粒状，松散易碎。
适的建立与继代培养
愈伤组织
1-2g愈伤/10-20ml培养基
100、250ml三角瓶（30、70ml培养基）
120rpm,25℃黑暗培养, 初始培养换液1次/3d以防粘稠
蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团)
• 次级代谢产物(Secondary metabolites)：是通 过次级代谢合成的产物，大多是分子结构 比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、 激素、色素、生物碱、毒素等。
二、植物细胞培养生产代谢产物的 意义
例：紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植 中分离得到的一种双 萜类化合物。C47H51NO14， 分子量：853.90 用途： • 具有良好的抗癌活性，尤其对晚期 、转移性卵巢癌、乳 腺癌、肺癌有 、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有 十分显 著的疗效。 制备途径： • 1.直接从红豆杉中提取； • 2 化学全合成 化学半合成 ； • 3.内生真菌培养； • 4.植物细胞培养。
• 类型：
（1）半连续培养 指每隔一定时间后倒出一定量的悬浮液，并 同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大 量、均一的培养细胞，供生物研究之用。 （2）连续培养 封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。 开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
a.恒化培养 b.恒浊培养
• 连续培养的特点
（一）细胞株的诱导与筛选
• （1）分散性好，适合大规模悬浮培养；
• （2）均一性好，细胞大小、生理状态一致； 适合大规模培养的细
胞株应具备何条件？ • （ 3）生长速度快，培养周期短，不易染菌；
• （4）目标产物含量高，容易分离提取； • （5）细胞遗传稳定。
1、细胞株的诱导
愈伤组织的诱导与培养 单细胞的分离 细胞无性系的分离
（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的 充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足 的现象。 （2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中 。细胞增殖速度快。 （3）适于大规模工业化生产。
第三节 规模化细胞培养生产次 级代谢产物
一、代谢产物( metabolites)
• 初级代谢产物(Primary metabolites)：生物通 过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所 必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、 脂类、维生素等。
2、细胞株的筛选与增殖培养
• 单细胞培养
• 多次继代筛选
3、筛选细胞株的增殖培养
悬浮培养（摇瓶培养），逐级放大，获得
大量的活跃生长的种子细胞群体；
细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化和
变异。
培养基的选择
两步培养技术 P91
• 培养基 既要满足植物 1977年Zenk提出： 细胞的生物量 (1)维持培养基(maintenance media) 增长，还要满 足细胞合成及 ——尽可能快的使细胞量增长 积累次生产物 的需要。
一、细胞悬浮培养技术
• 悬浮培养包括：
– 愈伤组织的诱导; – 悬浮系的建立与细胞的生长增殖
(一)愈伤组织的诱导
• 适宜于细胞悬浮培养的愈伤组织要求：松 散性好（疏松易碎）、增殖快。
– 适宜的外植体：幼茎、叶柄等是最常使用的外 植体 – 适宜的培养基：适当的激素浓度；较低的蔗糖 浓度；必要的附加物质 – 多次继代筛选
• 化学合成 ：结构复杂，全合成需要几十步合成步 骤 ，总得率仅4-5%。成本高
利用植物细胞培养技术生
产植物产品显然是工业化生 产植物产品的一条有效途径
三、规模化细胞培养
植物细胞规模化培养过程
• （一）诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织, 建立悬浮细胞系
• （二）筛选高产细胞系（细胞株，种子细 胞） • （三）大量培养细胞（/团）并适时采收
1、细胞平板培养
• 将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养 基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创
– 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不 能超过6个细胞。 – 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗 涤2次以后，调整密度为5×105个/毫升
– 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份
• 优点：细胞不受伤害，可获得较多的游离 细胞或小的细胞团。
二、 单细胞培养技术（single cell culture）
1、平板培养(plating culture) 2、看护培养(nurse culture)
3、微室培养(micro-chamber culture) 4、双层滤纸培养(feeder layer cultur)
4、双层滤纸培养（饲养层培养）
把处理（如X射线处理）过的无分裂能力或分裂 很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生 长。
第二节 悬浮培养
细胞悬浮培养（Cell
suspension culture)：将 单个游离细胞或小细胞 团悬浮于液体培养基中 ，在保持良好细胞分散 状态下进行培养（悬浮 振荡培养）的技术。
作用：消除关键酶的阻碍、阻断内源性中
间体的分隔和有效贮存，大大提高次
生代谢物的产量。 烟草：天仙子胺
尼古丁产量降低 新烟碱含量大大提高
生物反应器的选择
• 适合植物细胞悬浮培养的生物反应器的特 点：
合适的氧传递； 良好的流动性； 较低的剪切力。
生物反应器的类型及特点
• 1、悬浮培养系统生物反应器
缺点：过高的剪切力，易对植物细胞 造成伤害。
气升式生物反应器
5L 气升式植物细胞（或器官）培养罐
内环式
外环式
气 升 循 环 式 生 物 反 应 器
鼓泡式生物反应器
气动式生物反应器
利用空气为动力，带动培养容器中的 液体流动。适宜于植物细胞培养的一类生 物反应器
• 优点：剪切力小，对细胞损伤小，易长期 无菌培养。 • 缺点：操作弹性小，低气速或培养后期混 合效果差；此时如果提高通气量又会产生 大量泡沫。
植物细胞分离方法
• 酶解法:选择专一性水解酶在温和的条件下 将植物细胞壁物质(纤维素、果胶、多糖)降 解,从而使细胞彼此分开,获得单个细胞的方 法。
• 优点：可获得较多的游离细胞（但对禾本 科植物叶片效果不好）。
植物细胞分离方法
• 愈伤悬浮法：从未分化的疏松易碎的愈伤 组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或 小细胞团。
35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平 铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。
克隆愈 伤组织
细胞悬浮
过滤
与培养基 混合
植板
培养
• 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板 率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总 和中所占的比例。
每个平板形成的细胞团数
植板率＝
每个平板接种的细胞总数
×100%
• 优点：
(2)生产培养基(production media) ——诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物
加入诱导剂或前体物
(1)诱导剂： 可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质。 无机离子、真菌提取液、葡聚糖等。 作用机理: 可以调节代谢进程某些酶的活性,并对某些关键酶 在转录水平上进行调节。
(2)前体物
Muir(1953)首创 此法获得烟草 单细胞体系。 • 优点：简便易 行，效果好。 • 缺点：不能在 显微镜下追踪 细胞分裂、生 长过程。
3、微室培养
细胞起始密度：30～80个/室
• 优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一 个细胞的生长、分裂、分化等过程 • 缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动 幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
• 2、固定化培养系系统生物反应器
植物悬浮培养的生物反应器
• 特点：具有合适的氧传递、良好的 流动性和低的剪切力。
①悬浮培养生物反应器类型
机械搅拌式
气动式（气升式，鼓泡式）
机械搅拌式生物反应器
• 机械搅拌式生物反应器通常是在微生 物发酵罐的基础上改进设计。 优点： 1）培养环境保持基本稳定（氧气，二 氧化碳，温度，pH等） 2）搅拌充分，细胞供氧和混合效果好
• 细胞悬浮培养(小的细胞团) • 大规模细胞培养(大量培养细胞)
第一节 植物的单细胞培养
一、植物细胞分离方法
• 机械分离法：从完整植物器官和组织中分 离单细胞的方法。常用的是叶片（叶肉组 织排列疏松）。将叶片轻轻研碎、过滤、 离心、收集、净化
• 优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞 的生理和生化研究。
第八章
植物的细胞培养 及次生代谢产物生产
培养过程：
培养物 愈伤组织诱导培养基 再分化培养基
外植体 植物细胞培养（ Plant Cell Culture）:
在离体条件下，对植物单个细胞或小的 愈伤组织
不定芽 细胞群体的技术。 根形成
细胞团进行培养和继代培养，大量获得
生根培养基
植物细胞培养的类型
• 单细胞培养(单个细胞)
悬浮培养系统的优点
• 1）可以保证良好的混合状态，增加细胞与 培养液的接触面，促进营养的吸收，获得 良好的气体传递效果。
• 2）细胞生长快，能大量提供比较均匀的细 胞。 • 3）可以借鉴发酵工程的成熟技术，容易放 大实现规模化。
②固定化反应器
• 细胞固定化：指将游离的细胞包埋在
多糖或多聚化合物制备成的网状支持
100-110rpm（悬浮细胞系稳定以后）
继代培养
继代时间为1周时（ 原悬浮液：新培养基=1：4 ）
悬浮细胞的起始密度 一般在104×105个细胞/毫 升
成功的悬浮细胞培养体系满足三个条件：
悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在20～ 50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞 组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮 系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞 色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长 量一般2～3天甚至更短时间便可增加 一倍。
实例分析：P87
二、悬浮培养工艺
• 1、分批培养：培养体系（培养基、培养物
）处于封闭状态，既
不向培养系统中补充
培养基也不从系统中排出培养物，（一次 性加入培养基，一次性收获培养物）。
悬 浮 细 胞 的 生 长 动 态
指
2、连续培养
在培养过程中，不断排出悬浮培养 物并注入等量新鲜培养基，使培养物不 断得到养分补充，保持其恒定体积的培 养。 •