基于基因组测序揭示香稻Badh2基因的变异信息

DOI:10.16498/ki.hnnykx.2019.008.001
水稻（Oryza sativa L）是世界上重要的粮食作物之一，全世界约有超过1/2 的人以水稻为主食[1]。

香味是稻米品质的一个重要特征，香米不仅在蒸煮后清香可口，而且具有更高的营养价值，因此在国际市场上占有特殊的地位，其销售价格比普通大米高1倍以上。

印度和巴基斯坦生产的巴斯马蒂（Basmat）香米、东南亚地区广泛种植的茉莉（Jasmine）香米，因其具有浓郁的香味，在欧洲、北美、澳大利亚、西非、中国等市场上备受欢迎[2]。

香稻含有多种挥发性化合物，其中直接与水稻香味相关的挥发性物质为2-乙酰1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2AP)[3-4]。

由于甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2功能的缺失会导致2AP前体物质的增加，从而积累2AP使水稻产生香味[5]。

Ahn et al通过一系列的分子标记定位表明香味基因是位于8号染色体上的隐性基因[6]。

Bradbury et al [7]在香稻和非香稻材料的fgr区域进行序列测定，最终确定控制甜菜醛脱氢酶(BADH2)的基因Badh2为控制香味性状的基因。

香稻中无功能的BADH2蛋白是Badh2基因编码区中第7外显子有8 bp的缺失（命名为badh2.1或badh2-E7），导致翻译提前终止而产生，中断了2AP合成底物Y-氨基丁醛的代谢，使其转而生成了香味物质2AP。

随着香味基因的克隆和大量香稻的收集，研究者对香味基因位点的变异情况进行了深入研究，除badh2-E7外，目前共发现有20余种badh2的等位基因[8-12]。

除了编码区 SNPs 或 InDels 引起非同义突变或移码框突变而导致无功能的BADH2蛋白产生的变异类型外，还有一些Badh2基因的变异发生在内含子区、启动子区及5’UTR 区，携带这些变异类型的水稻品种大多散发独特的香气。

因此，对不同香稻品种Badh2基因的序列进行分析，探明其变异发生的区域及及进行成香机理研究，对充分发掘、利用香稻种质资源以改善农业种植结构，推进优质香米产业化，提高我国香米的国际市场竞争力都具有十分重要的意义。

课题组利用二代测序技术对来源于同一优质香型材料的3个香稻品种XW13、YZX及XW17进行全基因组测序，对其Badh2基因的编码区、内含子区及启动子区进行序列分析，明确其香味基因的变异类型。

同时，结合已公开发表的3 010份水稻资源中76份香稻资源的序列信息，对不同香稻资源的Badh2基因进行变异分析。

 基于基因组测序揭示香稻Badh2基因的变异信息 
 刘之熙，朱克永，闵　军，刘三雄，陈彦成 
（湖南省水稻研究所，农业部长江中下游籼稻遗传育种重点实验室，湖南 长沙 410125）
摘　要：香稻是一种具有芳香气味的特种稻资源，具有较高的营养价值和经济价值。

利用二代测序技术对3个香稻品种XW13、YZX及XW17进行全基因组测序，发现3个香稻品种的Badh2基因序列一致，在编码区无明显变异的情况下，启动子区有1个 8 bp的插入突变，这种变异类型在已测序并公开发表的76份香稻资源的Badh2基因序列中也有发现，命名为badh2-p。

关键词：香稻品种；Badh2基因变异；启动子；SNP；InDel
中图分类号：Q812, S511 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2019）08-0001-04 R evealing the Variation Information of Badh2 Gene in Aromatic Rice Based on
Genome Sequencing
LIU Zhi-xi，ZHU Ke-yong，MIN Jun，LIU San-xiong，CHEN Yan-cheng （Hunan Rice Research Institute, Key Laboratory of Indica Rice Genetics and Breeding in the Middle and Lower Reaches of Yangtze River,
Minister of Agriculture, Changsha 410125, PRC）
Abstract：Aromatic rice is a special rice resource with aromatic odor, which has high nutritional and economic value. The whole genome of three aromatic rice varieties XW13, YZX and XW17 was sequenced by second-generation sequencing technology. The sequence of Badh2 gene of three aromatic rice varieties was identical. Without obvious variation in coding region, there was an insertion mutation of 8 bp in promoter region. The variant type was also found in the Badh2 gene sequence of 76 fragrant rice resources, named badh2-p.
Key words：a romatic rice varieties; Badh2 gene variation; promoter; SNP; InDel
收稿日期：2019-06-20
基金项目：湖南省自然科学基金青年基金项目（2019JJ50334）；湖
南省农业科技创新资金项目（2018QN06）
作者简介：刘之熙（1981-），女，山西长治市人，助理研究员，主
要从事水稻分子育种和种子质量检测技术研究。

　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES ）2019年8月1　材料与方法
1.1　3个香稻品种XW13、YZX 及XW17的全基因组测序
3个香稻品种XW13、YZX 及XW17的种子使用75%酒精消毒后播种于发芽盒中，30 ℃（16 h 昼/8 h 夜）生长。

利用CTAB 法提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分析DNA 降解程度以及是否有RNA 污染， Nanodrop 检测DNA 的纯度（OD 260/OD 280比值）， Qubit 对DNA 浓度进行精确定量。

OD 值在1.8~2.0 之间，含量在1.5 μg 以上的DNA 样品通过Covaris 破碎机随机打断成长度为350 bp 的片段，采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，DNA 片段经末端修复、加ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。

构建好的文库通过Illumina HiSeq 进行测序。

1.2　基因组组装、注释及SNP、InDel 检测分析
利用 base calling (Illumina pipeline CASAVA v1.8.2)得到Raw data，通过质控程序，将含有Illumina 文库构建接头的reads、一端含有超过10% 未知碱基 (N bases) 的reads、一端含有超过50% 低质量碱基(sequencing quality value ≤5)的reads过滤掉，得到Clean data。

利用BWA [13]软件（参数：mem-t 4-k 32 -M）将Clean data 比对到参考基因组Os-Nipponbare- Reference-IRGSP-1.0上。

利用SAMTOOLS [14]（mpileup-m 2-F 0.002-d 1000）进行SNP 和InDel 检测，得到3个香稻品种的SNP 和InDel 变异信息。

利用ANNOVAR 对SNP 和InDel 的检测结果进行功能注释，根据SNP/InDel 在基因组上的位置，将其分为编码区SNP/InDel、内含子区SNP/InDel、剪切位点SNP/InDel、基因上游SNP/InDel、基因下游SNP/InDel 和基因间区SNP/InDel ；根据SNP/InDel 在编码区引起的功能突变，将其分为非同义突变SNP、同义突变SNP、移码框突变InDel、非移码框突变InDel、使基因获得终止密码子突变SNP/InDel 和使基因失去终止密码子突变SNP/InDel。

1.3　3个香稻品种及76份香稻资源中Badh2基因的变异类型分析
从3个香稻品种的测序数据中提取Badh2基因及其启动子区（上游1 500 bp）的SNP 和InDel 信息，从/网站下载3 010份测序水稻资源中76份香稻资源的Badh2基因及其启动子区的SNP 和InDel 信息，比较这些品种或资源中Badh2基因的变异类型，揭示Badh2基因的变异信息。

2　结果与分析
2.1　3个香稻品种XW13、YZX 及XW17的基因组图谱
基于Illumina 技术测序平台，利用双末端测序的方法，对XW13、YZX 及XW17进行了全基因组测序， 产生的 Raw data 在12 285.038~14 827.401 M之间，过滤后的 Clean data 在12 267.991~14 808.401 M 之间。

通过BWA 软件比对到日本晴参考基因组IRGSP-1.0上，比对率在91.61%~96.71%之间，对参考基因组（排除N 区）的平均覆盖深度在30.46~36.77X 之间，1X 覆盖度（至少有一个碱基的覆盖）在91.05%以上。

2.2　3个香稻品种SNP、InDel 变异信息
利用SAMTOOLS 对XW13、YZX 及XW17进行SNP 和InDel 检测，各品种检测到的SNP 数目介于1 706 194~1 868 460之间，InDel数目介于296 674~ 318 410之间。

利用ANNOVAR 对检测结果进行注释，得到各品种SNP 和InDel 注释结果信息，见表1和表2。

各品种SNP 和InDel 在基因组上的分布频率见图1和图2（以XW13为例）。

2.3　3个香稻品种及76份香稻资源中Badh2基因的变异类型
与日本晴参考基因组IRGSP-1.0相比，3个香稻品种的Badh2基因序列一致，20 378 294 bp~20 386 061 bp （Badh2基因及其启动子）区域内共检测到8个SNPs 和6个InDels，突变主要发生在启动子区，编码区未检测到SNP 和InDel 变异。

其中，启动子区有1个8 bp
表1　3个香稻品种SNP 检测及注释结果统计
品 种上 游外显子
内含子剪切位点基因间区共 计使基因获得终止密码子使基因失去终止密码子
同义突变非同义突变XW13248 2656 441992106 351163 044278 7081 743780 2371 820 715YZX 230 0375 915939100 039152 145262 7061 586734 0751 706 194XW17
253 384
6 483
1 007
109 293
166 160
285 651
1 716
804 100
1 868 460
表2　3个香稻品种InDel 检测及注释结果统计
品 种上 游外显子
内含子剪切位点基因间区共 计使基因获得终止密码子
使基因失去终止密码子
移码突变非移码突变XW1351 878218297 5647 61753 483203146 058314 769YZX 48 179204297 0327 01350 708205138 580296 674XW17
52 205
230
34
7 604
7 822
53 753
220
148 306
318 410
刘之熙 等：基于基因组测序揭示香稻Badh2基因的变异信息
的插入突变，与已报道的日本香稻Nankai 138在启动子 区具有相同的插入序列，因此，将这一变异类型命名 为badh2-p。

日本香稻Nankai 138除启动子区存在 8 bp 的插入外，在5’UTR 区还有一个3 bp 的缺失，因此 将其Badh2基因的变异类型命名为badh2-p -5’UTR [15]。

对76份香稻资源的Badh2基因及其启动子区进行SNP 和InDel 分析，发现有26份资源在第7外显子存在 8 bp 缺失，Badh2基因的变异类型为badh2-E7；有30份资源在启动子区存在8 bp 插入，
Badh2基因的变异类型与XW13、YZX 及XW17相同，
为badh2-p ；其中有17份资源的变异类型为badh2-E7 +badh2-p 。

有3份资源在启动子区存在3 bp 缺失，将其Badh2基因的变异类型命名为badh2-p .1；1份资源在启动子区存在 6 bp 缺失，将其Badh2基因的变异类型命名为badh2-p .2；2份资源在启动子区存在6 bp 插入，将其Badh2基因的变异类型命名为badh2-p.3；其余31份资源在编码区和启动子区均无明显变异。

不同Badh2基因的变异类型在76份香稻资源中的具体
图1　XW13中SNP
在基因组上的分布频率
图2　XW13中InDel 在基因组上的分布频率
　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES ）2019年8月分布见图
3。

图3　不同Badh2基因的变异类型在76份香稻资源中的分布
3　小结与讨论
前人对控制香味性状的甜菜碱醛脱氢酶基因（Badh2）的研究主要集中在编码区和内含子区碱基的插入、缺失或突变导致翻译提前终止而产生无功能的BADH2蛋白，中断了2AP 合成底物Y-氨基丁醛的代谢，使其转而生成了香味物质2AP。

对启动子区的变异研究较少。

利用二代测序技术对3个香稻品种XW13、YZX 及XW17进行全基因组测序，发现在Badh2基因编码区无明显变异的情况下，启动子区有1个 8 bp 的插入突变，这种变异类型在已测序的76份香稻资源中也有发现，命名为 badh2-p 。

有研究表明，若基因在编码区上游500 bp~1500 bp 的区域内存在较多的InDels，其发生差异表达的频率较高[16]。

因此，测序得到的 badh2-p 是否会影响其Badh2基因的表达水平，进而影响香味物质2AP 的积累使品种产生香气的分子机制，有待深入分析研究。

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（责任编辑：高国赋）。