ROSp38MAPK通路对结直肠癌SW480细胞侵袭能力的影响

医学研究杂志2021年1月第50卷第1期•论著-
ROS/p38MAPK通路对结直肠癌
SW480细胞侵袭能力的影响
谢海娟龙文清王毓兴姜媛俞红女
摘要目的探究ROS/p38MAPK通路对PKC诱导人结直肠癌SW480细胞MMP-9表达及细胞侵袭的作用机制。

方法利用蛋白激酶C(PKC)激动剂12-O-十四烷基酚-13-乙酸酯(TPA)处理人结直肠癌SW480细胞，并且进行PKC抑制剂/ ROS抑制剂/p38抑制剂干扰。

通过WesLern bloL法检测MMP-9、p38/p-p38以及核内p65蛋白表达水平；激光共聚焦检测细胞内ROS含量；明胶酶谱法检测MMP-9细胞外分泌情况,Transwell实验检测细胞侵袭能力。

结果TPA增加细胞内ROS的生成和p38的磷酸化，可诱导p65和MMP-9的表达上调；而预处理PKC抑制剂/ROS抑制剂/p38抑制剂能够阻断TPA诱导的ROS 生成和p38磷酸化，下调核内p65蛋白的表达,进而使TPA诱导的SW480细胞MMP-9表达及细胞侵袭能力显著下降。

结论ROS介导p38MAPK信号通路调控转录因子NF-k B,促进结直肠癌细胞MMP-9表达及侵袭发生；PKC诱导SW480细胞侵袭中的潜在作用机制，为结直肠癌转移研究提供新的思路。

关键词结直肠癌细胞活性氧促分裂原活化蛋白激酶p38基质金属蛋白-9侵袭
中图分类号R735.3文献标识码A DOI10.11969/j.issn.1673-548X.2021.01.020
Effect of ROS/p38MAPK Pathway on Invasion of Colorectal Cancer SW480Cells.Xie Hai/'uan,Long Wenqing,Wang Yuxing,et al. Xinhua Hospital of Dalian University,Liaoning116021,China
Abstract Objective To invesLigaLe Lhe mechanism of ROS/p38MAPK paLhway on MMP-9expression and cell invasion in human colorecLal cancer SW480cells induced by PKC.Methods Human colorecLal cancer SW480cells was LreaLed wiLh proLein kinase C (PKC)agonisL12-O-LeLradecylphenol-13-aceLaLe(TPA),and PKC inhibiLor/ROS inhibitor/p38inhibitor interference was per­formed.WesLern bloL was used Lo deLecL Lhe expression of MMP-9,p38/p—p38,and nuclear p65proLein.The inLracellular reacLive ox­ygen species(ROS)conLenL was deLecLed by confocal microscope and Lhe secreLion of MMP-9was deLecLed by gelaLin zymography assay, and Lhe invasion abiliLy of cells was deLecLed by Transwell LesL.Results TPA increases Lhe generation of ROS and phosphorylaLion of p38 in cells,which can induce Lhe up一regulation of Lhe expression of p65and MMP-9.The preLreaLmenL of PKC inhibitor/ROS inhibitor/ p38inhibitor can block TPA一induced ROS generation and p38phosphorylaLion,and down一regulation of Lhe expression of p65proLein in Lhe nucleus.Then TPA一induced expression of MMP-9and cell invasion abiliLy were significanLly reduced in SW480cells.Conclusion ROS mediaLes p38MAPK signaling pathways Lo regulaLe LranscripLion facLor NF一k B for furLher promoting MMP一9expression and inva­sion of colorecLal cancer cells.IL indicates Lhe poLenLial mechanism of PKC-induced SW480cell invasion and provides new ideas for Lhe research on colorecLal cancer meLasLasis.
Key words ColorecLal cancer；ReacLive oxygen species(ROS)；MiLogen-acLivaLed proLein kinase P38；MaLrix meLalloproLeinase-9; Invasion
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道常见的恶性肿瘤，在全球范围内,其病死率在恶性肿瘤中位居第2位,约15%〜20%的患者初诊时已发生脏器的远处转移［1，2］。

目前，尽管CRC在临床治疗方面取得了显著的进步，如放疗、化疗、手术切除、生物
基金项目：辽宁省博士启动基金资助项目(20170520269)
作者单位：116021大连大学附属新华医院肿瘤内科(谢海娟、姜媛)，中心实验室(龙文清、王毓兴、俞红女)
通讯作者：俞红女，电子信箱:hongnvyu2312@ 靶向和免疫疗法的综合治疗方法,但是CRC患者的预后仍不理想,尤其是晚期的CRC由于较高的局部复发和远处转移，其5年总生存期(OS)率不到10%,因此进一步提高疗效仍面临着巨大挑战［3］。

肿瘤侵袭转移是肿瘤患者治疗失败的主要原因,也是肿瘤临床治疗和基础研究的重点、焦点⑷。

侵袭是肿瘤向血管外以及邻近组织转移的起始阶段,也贯穿着癌症发展的全过程。

基质金属蛋白酶(MMPs)是肿瘤转移过程中非常重要的调控分子,主
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要通过降解ECM和基膜发挥其生物学效应［5］。

MMP-9是MMPs家族中的重要成员，已有报道证实在脑、前列腺、乳腺、结直肠癌等肿瘤患者中MMP-9的表达水平与其转移程度及预后密切相关［6~9］。

已有报道指出，TNF、12-O-十四烷基酚-13-乙酸酯(TPA)等可激活细胞内多种信号通路诱导MMP-9的表达，其中转录因子如c-fos、核因子-k B(NF-k B)和激活蛋白-1(AP-1)等参与调控MMP-9的表达［l0］o这些诱导因子中TPA是蛋白激酶C(PKC)的特异性激活剂，在诱导肿瘤细胞侵袭及转移过程中发挥着重要作用［11］。

活性氧(ROS)作为信号分子,在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用［12］。

已有研究表明,PKC的激活可诱导ROS的产生,并进一步激活AP-1和NF-k B信号通路［13，14］。

因此，探究MMP-9及其上游途径的调控机制,将是恶性肿瘤研究和治疗的重要方向。

本研究观察PKC诱导结直肠癌细胞的侵袭作用，探讨ROS/p38MAPK通路参与PKC/MMP-9表达及细胞侵袭的作用机制，为治疗结直肠癌侵袭转移提供多靶点理论依据。

材料与方法
1.材料：人结直肠癌SW480细胞株购自中国科学院上海细胞库,RPMI1640培养基购自美国Gibco 公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司；TPA、CF109203X、NAC、SB203580购自美国Sigma公司；Bradford蛋白浓度检测试剂盒、ECL试剂盒购自北京索莱宝公司；anti-p38、anti-p-p38、anti-0-actin 购自美国Abcam公司；anti-p65、anti-MMP-9、HRP标记IgG购自美国Santa Cruz公司；Transwell侵袭系统购自美国Costar公司。

2.细胞培养：利用含有10%FBS的RPMI1640完全培养基，在5%CO2的37T培养箱中培养结直肠癌SW480细胞，当达到80%~90%融合度时进行细胞传代培养。

3.Western blot法:根据实验目的进行100nmol/L TPA处理，或预处理PKC抑制剂GF109203X (1“mol/L)、ROS抑制剂NAC(50“mol/L)、p38抑制剂SB203580(20“mol/L),1h后与100nmol/L TPA共孵育。

用总蛋白提取液或核蛋白提取试剂盒提取蛋白，每孔以30憾蛋白上样,SDS-PAGE电泳进行分离蛋白,并PVDF膜转移,5%脱脂牛奶封闭2h,在4T环境下孵育一抗过夜,TTBS洗膜,常温孵育二抗2h,再次洗膜,ECL试剂盒显影，利用图像分析仪观察蛋白表达水平。

4.活性氧检测：为了动态实时观察细胞内活性氧浓度的变化，利用激光共聚焦显微镜检测。

细胞培养在100g/ml poly-L-lysine涂层的共聚焦培养皿3h, HBSS缓冲液洗3次,2,7-dichlorofluorescin dictate (DCF-DA)荧光探针孵育1ho根据实验目的同时预处理各种抑制剂1h,洗涤3次，在488nm激发/530nm 发射下，待荧光信号稳定后给与TPA处理,用光电倍增管收集530nm处发射的荧光,共聚焦显微镜(Ni-kon)动态检测分析活性氧的含量。

5.明胶酶谱法：使用无血清的培养基处理各组细胞,24h后收集细胞上清液，与非还原缓冲液混合制备上样品，在0.1%明胶的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,2.5%Triton X-100缓冲液洗涤30min,在37T环境中以0.02%Brij,5mmol/L CaCl2,50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液孵育过夜。

进行0.25%考马斯亮蓝染色以及脱色，在图像分析仪上拍照分析。

6.Transwell侵袭实验检测：各组细胞悬液加入到有基质胶的上室，下室以条件培养基共孵育24ho然后，用棉签将留在腔室上侧的细胞除去,腔室下侧的细胞用0.1%甲醇固定并用甲苯胺蓝溶液染色,利用光学显微镜检测腔室下侧的侵袭细胞。

7.统计学方法：采用SPSS16.0统计学软件对数据进行统计分析，数据用均数士标准差(x士s)表示,组内比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1.TPA对结直肠癌SW480细胞MMP-9蛋白表达的影响：利用免疫电泳法观察PKC激动剂TPA100nmol/L处理不同时间时细胞内MMP-9蛋白表达的情况。

与0h比较,TPA诱导MMP-9蛋白表达上调，即呈时间依赖性,表明结直肠癌细胞中PKC激活可诱导MMP-9的表达上调(P<0.01,图1)o
2.TPA对结直肠癌SW480细胞ROS生成的影响：为了研究TPA诱导细胞侵袭过程中对ROS的作用，利用激光共聚焦测定了细胞内ROS的变化。

与对照组比较,TPA组细胞内ROS水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与TPA组比较，预处理PKC抑制剂GF109203X或ROS抑制剂NAC后细胞内ROS水平明显降低，差异均有统计学意义(P< 0.01,图2)。

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TPA 0
0.5 1.0 3.0 6.0P-actin
3. ROS 对结直肠癌SW480细胞p38MAPK 通路 的激活作用：为进一步观察TPA 诱导MMP -9的分
子通路,检测了 TPA 诱导下p38的磷酸化情况。

100nmol/L TPA 在不同时间处理可时间依赖性上调
5 4 3 2 1
*
*
0.5 1.0 3.0 6.0 12 24 (h)
TPA(100nmol/L)
图 1 TPA o
p-p38的表达，在0. 5h 时表达上调最为明显(P <
0.01,图3A)；与TPA 组比较，预处理PKC 抑制剂
GF109203X 或ROS 抑制剂NAC 后p - p38表达明显下调(P <0.05,图 3B)o
4. ROS/p38MAPK 对结直肠癌SW480细胞NF -k B 通路的影响：为了证实ROS/p38MAPK 介导细胞
侵袭的分子机制,利用PKC 抑制剂/ROS 抑制剂/p38抑制剂预处理,然后与TPA 共孵育,Western blot 法检 测核内NF - k B 亚基p65的表达情况。

结果显示，与
对SW480细胞MMP-9蛋白表达的影响
与空白对照组比较,* P <0.01
—TPA
600
—ROS 抑制剂500
—PKC 抑制剂
F
*^r M s
史
*
对照组 TPA TPA+GF TPA+NAC
图2 TPA 对结直肠癌SW480细胞ROS 的作用
与对照组比较,* P <0.01；与TPA 组比较,#P <0.01
0.0
塞
I
t
--
■
.5C
.5 oo E d so E d —
d 0
0.25 0.5 1.0
TPA(100nmol/L)
.O .5.O .5.02 L L 0 0
oo E d ao E d —
d o
图3 TPA 对SW480细胞p38MAPK 通路的激活作用
A. TPA 对p38磷酸化的影响；
B.各种抑制剂对TPA 诱导p38磷酸化的影响；与对照组比较,
* P <0.01；与 TPA 组比较,# P <0.05,## P <0.01
对照组比较,TPA 明显上调核内p65蛋白的表达 ROS 抑制剂、p38抑制剂明显下调p65核内表达(P <
(P <0.01)；与TPA 组比较，预处理PKC 抑制剂、 0.01,图4)o
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TPA—+
GF109203X——
NAC ——
SB203580——
p65
图4ROS/p38通路对核转录因子NF-k B的影响与对照组比较,*P<0.01；与TPA组比较,#P<0.01
5.ROS/p38MAPK对TPA诱导结直肠癌SW480细胞MMP-9表达的影响：利用各种抑制剂预处理,采用蛋白印迹法检测MMP-9蛋白表达情况，明胶酶谱法检测MMP-9的分泌情况。

与对照组比较,TPA 组MMP-9蛋白表达及分泌显著增加(P<0.01)；与TPA组比较,PKC抑制剂、ROS抑制剂、p38抑制剂组的MMP-9表达及分泌均显著降低(P<0.01,图5)°
6.ROS/p38MAPK对结直肠癌SW480细胞侵袭能力的影响：利用Transwell检测TPA诱导的细胞侵袭能力。

TPA处理可诱导侵袭细胞数明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与PKC抑制剂、ROS抑制剂、P38抑制剂联合应用后,侵袭细胞数明显减少,且与单用TPA组比较差异有统计学意义(P<0.01,图6)°
TPA—++++
GF109203X——+——
NAC———+—
SB203580————+
图5ROS/p38通路对MMP-9蛋白表达及分泌的影响与对照组比较,*P<0.01；与TPA组比较,#P<0.01
讨论
近年来结直肠癌发生率呈逐年快速上升趋势,严重威胁我国人民的健康。

结直肠癌早期临床症状不典型,导致部分患者在初诊时就已发生了肿瘤播散转移,病死率居高不下[15]°肿瘤侵袭在癌症转移中起着至关重要的作用,抑制肿瘤复发及转移是癌症治疗的重要目标。

MMP-9是肿瘤浸润和转移过程中的关键蛋白水解酶,可以通过降解肿瘤微环境中的基质,破坏生化机械屏障,以获得到细胞运动性,浸润周围组织、侵袭血管淋巴管实现肿瘤转移的启动[16]°有研究表明，在多种肿瘤组织中MMP-9蛋白表达明显上调,
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图6ROS/p38通路对细胞侵袭能力的影响(甲苯胺蓝，x200)
A.空白对照组；
B.TPA组；
C.TPA+GF109203X组；
D.TPA+NAC组；
E.TPA+SB203580组；
与对照组比较,*P<0.01；与TPA组比较,#P<0.01
与患者的肿瘤侵袭、转移等不良事件密切相关,可作为评估肿瘤预后的风险因子,阻滞MMP-9表达及活性已成为预防和治疗肿瘤转移的研究焦点［17，18］。

因此，阐明MMPs在结直肠癌细胞内的激活途径和分子机制显得尤为重要。

PKCs属于蛋白激酶家族,在肿瘤发生、发展及转移过程中起着重要作用［19］o笔者的研究表明,PKC特异性激活剂TPA可增加结直肠癌细胞MMP-9蛋白的表达及分泌,促进肿瘤细胞的侵袭过程,而这种促进作用可被PKC抑制剂GF109203X所抑制。

这与相关研究中的TPA作为MMP-9的诱导剂参与多种信号通路激活的结论相符,也证实了在结直肠癌细胞中PKC激活可促进肿瘤侵袭转移［20］o
活性氧(ROS)是肿瘤发展的一个重要因素,可通过调控ROS的释放进一步介导肿瘤细胞的增殖、分化以及侵袭转移过程。

在肿瘤细胞中,TPA诱导激活PKC可促进ROS的释放,同时ROS的增加可以进一步增强MAPK的活性,促进人肝癌细胞和乳腺癌细胞的迁移侵袭过程［21］o促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是细胞内主要信息传递因子,参与调控肿瘤细胞的增殖凋亡以及MMP-9的表达［22］。

p38是MAPK家族中的重要成员,激活PKC可诱导p38磷酸化促进细胞的侵袭转移［23］。

本研究结果显示,PKC抑制剂和ROS抑制剂可阻滞TPA诱导的细胞内ROS生成和p38的磷酸化,验证了TPA诱导结直肠癌细胞侵袭过程中激活ROS/p38MAPK信号通路。

并且,PKC抑制剂、ROS 抑制剂和p38抑制剂均阻滞了SW480细胞MMP-9的表达及侵袭能力,进一步说明了TPA通过ROS-P38MAPK通路诱导MMP-9表达和细胞侵袭。

NF-k B是调控MMP-9基因表达的重要核转录因子,细胞内多种信号通路级联参与了NF-k B的激活。

在乳腺癌细胞中ROS、MAPK信号通路参与了NF-k B核转录因子的激活，进而调控MMP-9基因表达[24]o本研究结果显示,PKC抑制剂、ROS抑制剂、p38抑制剂均明显抑制TPA诱导的核内p65的表达增加，证实了ROS/p38参与PKC诱导结直肠癌细胞NF-k B信号通路的激活过程。

综上所述,TPA激活PKC诱导SW480细胞MMP-9表达及细胞侵袭,证实了ROS通过介导p38MAPK 信号通路激活NF-k B,进而促进MMP-9表达及细胞侵袭能力的分子机制,为结直肠癌转移治疗提供了新的思路。

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