糖原合成酶激酶3参与尼古丁调控支气管上皮细胞促纤维因子的分泌

㊃论 著㊃
D O I 10 3760 c m a j i s s n 1673-436X 2018 14 004作者单位:510000广州市胸科医院呼吸科通信作者:邹威凤,
E m a i l s z w e i 555@163 c o m
糖原合成酶激酶3参与尼古丁调控支气管
上皮细胞促纤维因子的分泌
邹威凤 盛青 周晓婷 黎希 刘锐强
ʌ摘要ɔ 目的 本研究旨在探讨尼古丁是否通过糖原合成酶激酶3β(G S K 3β)的活性变化及其对β-连环素信号的影响调控气道上皮细胞基质金属蛋白酶9(MM P -9)㊁血小板衍生生长因子A B
(P D G F -A B )和P D G F -B B 分泌㊂方法 尼古丁(6ˑ10-6
m o l /L )刺激人气道上皮细胞株(16H B E )
,采用W e s t e r nb l o t t i n g 方法检测刺激24h 后细胞中G S K 3β和抑制性磷酸化G S K 3β(P -G S K 3β)的表达水平㊂预先加入10μm o l /LG S K 3β特异性抑制剂S B 216763孵育1h ,再加入尼古丁刺激16H B E24h ,细胞免疫荧光和W e s t e r nb l o t t i n g 方法检测β-连环素胞浆和胞核的表达,用酶联免疫吸附试验检测MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 分泌㊂结果 尼古丁刺激24h 后P -G S K 3β的表达较未予尼古丁刺激的正常对照组明显升高,G S K 3β的表达下降㊂加入S B 216763后尼古丁刺激24h 组,β-连环素胞浆和胞核的表达较尼古丁组明显增加,同时MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 分泌量显著增加㊂结论
G S K 3β/β-连环素信号通路参与了尼古丁调控支气管上皮细胞MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 分泌㊂ʌ关键词ɔ 人气道上皮细胞株;尼古丁;糖原合成酶激酶3β/β
-连环素;促纤维因子基金项目:广东省自然基金项目(2015A 030310378㊁2016A 030313422)
;广州市卫生和计划生育科技项目(20161A 011034
)N i c o t i n e i n d u c e st h ee x p r e s s i o no ff i b r o g e n i c m e d i a t o r sv i a g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e3i nh u m a na i r w a y e p
i t h e l i a lc e l l s Z o u W e i f e n g S h e n g Q i n g Z h o u X i a o t i n g L i X i L i u R u i q i a n g D e p a r t m e n to f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e G u a n g z h o uC h e s tH o s p i t a l G u a n g z h o u510000 C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r Z o u W e i f e n g
E m a i l s z w e i 555@163 c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b j
e c t i v e T h ea i m o ft h e p r e s e n ts t u d y w a st ot e s t w h e t h e rn i c o t i n ei n d u c e st h e s e c r e t i o no
f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n -9 MM P -9 p
l a t e l e t -d e r i v e d g r o w t h f a c t o r -A B P D G F -A B a n d P D G F -B Bi n h u m a n b r o n c h i a le p i t h e l i a lc e l l s H B E C s i n v i t r o v i at h e G S K 3β β
-c a t e n i n s i g n a l i n g p a t h w a y M e t h o d s C u l t u r e dH B E C sw e r e e x p o s e d t on i c o t i n e 6ˑ10-6m o l L f o r 24h T h e e x p
r e s s i o n o fG S K 3βa n dP -G S K 3βw a s a s s e s s e db y W e s t e r nb l o t t i n g H B E C sw e r e i n c u b a t e dw i t hG S K 3βi n h i b i t o r S B 216763f o r 1h a n d s u b s e q u e n t l y s t i m u l a t e dw i t hn i c o t i n e T h e c y t o p l a s m i c a n dn u c l e a r o f β
-c a t e n i nw a s a s s e s s e db y W e s t e r nb l o t t i n g a n d i mm u n o f l u o r e s c e n c e t h e s e c r e t i o no f f i b r o g e n i cm e d i a t o r sw a s a s s e s s e d b y e n z y m el i n k e di mm u n o s o r b e n ta s s a y R e s u l t s W es h o w e dt h a tc e l l se x p o s e dt on i c o t i n ef o r24h e x h i b i t e d s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d P -G S K 3βe x p r e s s i o n a n d d e c r e a s e d G S K 3βe x p r e s s i o n S B 216763s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dc y t o p
l a s m i ca c c u m u l a t i o na n dn u c l e a r t r a n s l o c a t i o no f β-c a t e n i na n d i n c r e a s e dt h e s e c r e t i o n MM P -9 P D G F -A B a n d P D G F -B B f r o m H B E C s C o n c l u s i o n s T h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t n i c o t i n e i n d u c e s t h e s e c r e t i o no fMM P -9 P D G F -A Ba n dP D G F -B Bi n H B E C s i nv i t r ov i a t h eG S K 3β β
-c a t e n i n s i g n a l i n gp a t h w a y
ʌK e y w o r d s ɔ H u m a nb r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s N i c o t i n e G S K 3β β
-c a t e n i n F i b r o g e n i cm e d i a t o r s F u n d p r o g r a m N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f G u a n g d o n g P r o v i n c e 2015A 030310378 2016A 030313422 G u a n g z h o u M e d i c i n e a n dH e a l t hC a r eT e c h n o l o g y L e a dP r o j
e c t s 20161A 011034 ㊃
7501㊃国际呼吸杂志2018年7月第38卷第14期 I n t JR e s p i r ,J u l y 2
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我们前期发现香烟烟雾主要成分之一尼古丁通过W n t/β-连环素信号通路促进人气道上皮细胞株(h u m a nb r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l,16H B E)细胞发
生转分化样改变(e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n,E MT),气道上皮细胞发生E MT可能是C O P D气道结构重塑的重要机制之一㊂近年研究报道该通路的激活与特发性肺纤维化及气道结构细胞增殖及与肺纤维化的中心环节E MT过程密切相关,并且和转化生长因子β1有交叉对话,从而促进E MT[1]㊂与许多转录因子一样,β-连环素的水平也是受磷酸化调节的㊂研究证明糖原合成酶激酶3(g l y c o g e n s y n t h a s ek i n a s e3,G S K3)是可以磷酸化并下调β-连环素的主要激酶[2]㊂本研究旨在探讨尼古丁是否通过G S K3β的活性变化及其对β-连环素信号的影响调控气道上皮细胞促纤维因子基质金属蛋白酶9(m a t r i x m e t a l l o p o r t e i n a s e s9, MM P-9)㊁血小板衍生生长因子A B(p l a t e l e t-d e r i v e d g r o w t hf a c t o r-A B,P D G F-A B)和P D G F-B B分泌㊂
1材料与方法
11材料 16H B E(广州医科大学提供), D M E M培养基(美国G I B C O),尼古丁(美国S a n D i e g o公司),G S K3β,磷酸化G S K3β(p h o s p h o r i c G S K3β,P-G S K3β),P-G S K3抗体, G S K3β特异性抑制剂S B216763,β-连环素抗体(美国R&D公司),MM P-9㊁P D G F-A B和P D G F-B B酶联免疫吸附试验(e n z y m e l i n k e d i mm u n o s o r b e n ta s s a y,E L I S A)试剂盒(美国R&D公司)㊂
12正常16H B E培养及处理 10%小牛血清的D M E M培养液,按2ˑ10-5细胞/瓶将细胞接种于6孔板中,使细胞生长再次达到60%~70%融合㊂空白对照组换为无血清D M E M培养基,尼古丁组换为含6ˑ10-6m o l/L浓度的尼古丁的无血清D M E M培养基,24h后收集细胞㊂共分3组:空白对照组㊁尼古丁刺激组㊁S B216763+尼古丁组(每组设3个复孔)㊂根据实验时间取出培养板,各孔的培养上清液离心,取上清液于小离心管中-70ħ保存,备用㊂
13 G S K3β特异性抑制剂S B216763转染细胞干预前24h将细胞接种于6孔培养板,2m l含F B S的基础培养基,接种密度为2ˑ10-5/孔,使得次日进行干预时细胞融合达60%㊂将抑制剂10μm o l/LS B216763加入干扰组,预先培养1h㊂再继续加入尼古丁刺激培养24h㊂14 E L I S A检测16H B E MM P-9㊁P D G F-A B和P D G F-B B的分泌采用E L I S A试剂盒测定培养液MM P-9㊁P D G F-A B和P D G F-B B含量,检测方法按试剂盒说明书进行㊂
15统计学分析用S S P S170软件进行统计学分析㊂实验数据以x-ʃs表示,两个样本均数的比较采用t检验;多个样本均数比较采用单因素方差分析,P<005为差异有统计学意义㊂
2结果
216ˑ10-6m o l/L尼古丁干预24h对16H B E细胞G S K3β和P-G S K3β表达的影响6ˑ10-6m o l/L 尼古丁干预24h,收集细胞进行检测㊂W e s t e r n b l o t t i n g结果显示:尼古丁刺激24h后P-G S K3β的表达量较未给予尼古丁刺激的正常对照组明显增加,G S K3β的表达量较未给予尼古丁刺激的正常对照组明显减少,差异有统计学意义(P< 005)㊂见图1㊁2
㊂
注:G S K3β为糖原合成酶激酶3β;P-G S K3β为磷酸化糖
原合成酶激酶3β;G A P D H为磷酸甘油醛脱氢酶
图1 W e s t e r nb l o t t i n g显示尼古丁可导致气道上皮细胞中
P-G S K3β的表达量增加,G S K3β的表达量减少
22不同处理组中β-连环素胞浆和胞核蛋白表达的比较细胞免疫荧光和W e s t e r nb l o t t i n g检测显示,尼古丁刺激24h后β-连环素胞浆和胞核蛋白的表达量较未予尼古丁刺激的正常对照组明显增加(图3㊁4)㊂W e s t e r nb l o t t i n g检测显示,经G S K3β特异性抑制剂S B21676310μm o l/L预处理1h后再给予尼古丁干预,β-连环素胞浆和胞核蛋白在抑制组的表达量比单纯的尼古丁干预组明显增加,差异有统计学意义(P<005)㊂见图4㊁5㊂
23不同处理组中MM P-9㊁P D G F-A B和P D G F-B B蛋白分泌的比较结果 E L I S A检测显示,尼古丁刺激24h后MM P-9㊁P D G F-A B和P D G F-B B 蛋白的分泌量较未给予尼古丁刺激的正常对照组明显增加,经G S K3β特异性抑制剂S B216763 10μm o l/L预处理后再给予尼古丁干预24h,
㊃8501㊃国际呼吸杂志2018年7月第38卷第14期I n t JR e s p i r,J u l y2018,V o l.38,N o.14
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MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 蛋白在抑制组的
分泌量比单纯的尼古丁干预组明显增加,差异有统计学意义(P <0 05
)(图6)
㊂注:A 为P -G S K 3β的蛋白表达量;B 为G S K 3β的蛋白表
达量;G S K 3β为糖原合成酶激酶3β;P -G S K 3β为磷酸化糖原合成酶激酶3β
;G A P D H 为磷酸甘油醛脱氢酶;与对照组比较,a P <0 05图2 W e s t e r nb l o t t i n g 显示尼古丁可导致气道上皮细胞中
P -G S K 3β的表达量增加,G S K 3β
的表达量减少
注:A 为对照组;B 为尼古丁组图3 细胞免疫荧光尼古丁组β-
连环素胞浆和胞核蛋白的表达量增加
3 讨论
吸烟是公认的导致C O P D 发病和不可逆气流受限进展的最为重要的致病因素,其中主要成分尼古丁可能会通过上调WN T 信号通路促进气道成纤
维细胞转分化,而参与C O P D 中的气道重塑[3]
㊂
气道重塑是C O P D 发生发展最主要的机制之一[4]
㊂我们在前期研究中发现尼古丁通过W n t 3a /β-连环素信号通路及诱导转化生长因子
β1的分泌促进
16H B E 发生E MT [5]
㊂最近研究显示,香烟烟雾可
促进G S K 3的抑制性磷酸化[6]
,而G S K 3β可磷酸
化调节β-连环素,在经典的W n t 信号途径中起关
键性抑制作用[7]
㊂在胞浆中,G S K 3β与β
-连环素㊁A x i n ㊁A P C 和d i v e r s i n 构成多蛋白复合体(
毁坏复合体 ),其中β-连环素㊁A x i n 和A P C 都是
G S K 3β的底物㊂当W n t 信号缺乏时,G S K 3β可磷
酸化β-连环素,导致后者被β-重度转导蛋白(β
-t r a n d u c i nr e p e a t sc o n t a i n i n gp r o t e i n ,β-T r C P )识别并泛素化后在蛋白酶体中降解;G S K 3β还能
通过对蛋白复合体中另外两个成员A x i n 和A P C 的磷酸化调节从而促进β-连环素的磷酸化和降解㊂当W n t 信号异常激活时则抑制G S K 3β的活性,胞
浆中β-
连环素的水平随之升高,以致于其进入核内,促进靶基因的表达,引起细胞增殖分化的异常[
8
]㊂注:G S K 3β为糖原合成酶激酶3β
图4 W e s t e r n b l o t t i n g 显示G S K 3β特异性抑制剂
S B 21676310μm o l /L 组β-连环素胞浆和胞核蛋白在抑制组的表达量比单纯的尼古丁干预组增加注:G S K 3β为糖原合成酶激酶3β
;与对照组比较,a P <0 05;与尼古丁组比较,b
P <0 05
图5 W e s t e r n b l o t t i n g 显示G S K 3β特异性抑制剂
S B 21676310μm o l /L 组β-连环素胞浆和胞核蛋白在抑制组的表达量比尼古丁组增加
㊃
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注:E L I S A 为酶联免疫吸附试验;G S K 3β为糖原合成酶激酶3β;MM P -9为基质金属蛋白酶9;P D G F -A B 为血小板衍生生长因子A B ;A 为MM P -9的蛋白表达量;B 为P D G F -A B 的蛋白表达量;C 为P D G F -B B 的蛋白表达量;与对照组比较,a
P <0
05;与尼古丁组比较,b P <0
05图6 E L I S A 显示G S K 3β特异性抑制剂S
B 216763组MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 蛋白在抑制组的分泌量比单纯的尼古丁组增加当W n t 信号活化引起β-连环素在细胞核内聚集时,可作为该信号通路激活的标志
[9]
㊂结合我们
的前期研究实验,我们推测尼古丁可能通过
G S K 3β/β
-连环素信号通路调控气道上皮细胞MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 促纤维因子的分泌,从而参与了吸烟所致的C O P D 气道重塑㊂为
此我们观察了G S K 3β在尼古丁调控16H B E 细胞MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 分泌中的作用,我们用尼古丁处理细胞后检测G S K 3β㊁P -G S K 3β㊁β-连环素的表达和转位,研究发现尼古丁不仅抑制G S K 3β的表达,增强了P -G S K 3β表达,而且增强了β-连环素的表达并促进了β-连环素向核内转位㊂同时诱导了MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 的分泌㊂
S B 216763是一种具有高度选择性的小分子化合物,它能渗透进入细胞,从而特异性抑制G S K 3β的功能,激活W n
t 信号通路,使胞内β-连环素的表达增强,激活胞核靶基因的转录[
10
]㊂在本实验中,用G S K 3β的高选择性抑制剂S B 216763处理细胞后,发现细胞胞浆内β-连环素的表达较单纯尼古丁处理组明显增加及向细胞核内转移㊂更进一步诱导了MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 的分
泌㊂这说明G S K 3β可能在尼古丁诱导16H B E 促纤维因子的分泌中起重要作用㊂此外,实验中我们也发现G S K 3β抑制剂对MM P
-9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 促纤维因子的促进作用明显高于尼古丁处理组,这可能归因于S B 216763对G S K 3活性的强大的抑制作用㊂
通过分析我们的实验结果与既往的文献,提示G S K 3β可能通过促进β-连环素胞浆和胞核蛋白的表达参与了尼古丁诱导16H B E MM P -9㊁P D G F -A B 和P D G F -B B 促纤维因子的分泌,从而促进了吸烟所致C O P D 患者气道的重塑㊂参 考 文 献
1 I w a n oM P l i e t hD D a n o f f TM e t a l E v i d e n c e t h a t f i b r o b l a s t s d e r i v ef r o m e p i t h e l i u m d u r i n g t
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3118-3123 D O I 10 1073 p
n a s 0308648100 收稿日期 2017-12-13
㊃
0601㊃国际呼吸杂志2018年7月第38卷第14期 I n t JR e s p i r ,J u l y 2
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