P-糖蛋白与癫痫耐药

☞ABCB1 C3435T分型 应用聚合酶链反应-限制性片段长
度多态性(PCR-RFLP)。上游引物：5’-ACTCTTGTTTTCAGCTG CTTG-3’；下游引物：5’-AGAGACTTACATTAGGCAGTGACTC-3’。 反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火20s， 72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸5min。每10L PCR 扩增产物中加入限制性内切酶DPnⅡ0.5L，于37℃水浴过
2、P-gp对AEDs的影响 ①细胞水平 用同位素法测定细胞内的AEDs浓度，结果 显示耐药细胞内AEDs浓度明显低于正常细胞(Tishler DM,et al.)。用高效液相色谱法测定耐药和正常细胞内 AEDs的浓度，发现耐药细胞内AEDs浓度仅相当正常细胞 内的1/4左右，对耐药细胞采用维拉帕米干预后，可以提 高耐药细胞内AEDs浓度，直观的证实P-gp可以限制AEDs 进入细胞内(陈英辉,等)。
报道ABCB1 C3435T多态性、P-gp表达与癫痫耐药之
间无相关性(Tan NC,et al)。
ABCB1 SNPs 影响？ P-gp表达或/和功能 AEDs透过BBB 影响？ 癫痫耐药
3、P-gp实验研究 ①研究方法 ☞研究对象 本研究根据病例选择及排除标准，收 集癫痫患者187例，按照耐药标准分为耐药组100例， 敏感组87例。(1、漯河市第二人民医院；2、宁夏农 村癫痫示范项目)
②动物模型 研究发现耐药组中致痫灶P-gp的表达 明显高于敏感组；加用高选择性的P-gp抑制剂后， 耐药组大鼠的癫痫发作明显减少(Schmidt D,et al.)。在颞叶癫痫动物模型中，海马区P-gp表达增 加，该区域AEDs的浓度显著降低(van Vliet EA,et al)。表明P-gp过表达与癫痫耐药有关。
二、流行病学资料
3、AEDs治疗现状 目前癫痫的治疗仍然以AEDs为主。 在发展中国家，人们对癫痫缺乏正确认识以及医疗资源 匮乏，大多数癫痫患者得不到合理有效的治疗，存在很 大的“治疗缺口”。《指南》中指出我国活动性癫痫患 者的治疗缺口高达63%，据此估算大约有400万活动性癫 痫患者没有得到合理的治疗。
夜消化14～16h，3.5%琼脂糖凝胶电泳检测后确定ABCB1
C3435T基因型。
表2 耐药组和敏感组患者脑脊液、血清中P-gp浓度， 以及二者浓度比值比较
组别
脑脊液中P-gp浓度 血清中P-gp浓度 脑脊液与血清中
n
(ng/ml)
(ng/ml)
P-gp浓度比值
耐药组 100 敏感组 87
20.06±5.26 17.31±4.20
☞ 在癫痫患者的研究中，ABCB1 C3435T多态性与耐
药可能存在一定的联系(Hung CC,et al.)，影响部 分AEDs血药浓度，如携带CC基因型者PHT的血药浓度 最低(Kannan P,et al)，CC基因型患者脑脊液PB浓 度低于CT和TT基因型(Basic,et al.)。但也有研究
☞样本采集 上午空腹采集静脉血5 ml，置于EDTA抗凝 管中，常温下以3000 r/min离心15 min，分离血清及有形 成分；行腰椎穿刺术留取患者脑脊液2 ml；收集的血清和 脑脊液样本保存在-80℃冰箱中备用。
☞P-gp检测 血清及脑脊液中P-gp浓度采用ELISA测定， 测定步骤严格按照说明进行。
☞ 研究表明，新诊断的癫痫患者，如果接受规范、合理 的AEDs治疗，70％～80％患者的发作是可以控制的，其中 60％～70％的患者经2～5年的治疗可以停药，但有20％～ 30%的患者对各种AEDs不敏感，产生耐药。尽管各种新型 AEDs问世，癫痫耐药依然是癫痫药物治疗中的棘手问题， 也是目前研究热点之一。
☞P-gp作为机体本身的一种防御机制，在抵 抗外界有害物质的侵害、维持细胞内稳态中 起着一定作用，如果人为地降低P-gp的表达， 使BBB通透性增加，是否会导致其它神经毒性 物质也进入中枢神经系统，对中枢神经系统 造成损伤，目前仍无确切的研究证据。
结束语 癫痫的耐药机制十分复杂，而且 很难用任何一种学说完全解释癫痫的耐药 问题。因此，有关癫痫的耐药机制及耐药 性癫痫的治疗，有待进一步研究，任重而 道远。
②药物靶点学说 是指AEDs作用靶点的分子结构、功能、 位置的变化导致AEDs敏感性下降，这种变化可以是遗传 基因所决定的，或者是获得性的，即伴随着癫痫发作同 时发生，可能是发作、药物治疗的后果。AEDs控制癫痫 发作必须作用于脑内的分子靶点，这些靶点包括电压门 控式离子通道、神经递质受体以及影响神经递质释放、 吸收、转运、代谢的酶。
4、癫痫危害 癫痫对于个人、家庭和社会带来严重的负 面影响，如社会上存在对癫痫病的误解、对癫痫患者的歧 视、以及癫痫反复发作、长期服药等均严重影响患者及家 庭生活质量，带来沉重的经济负担。同时，癫痫患者的保 健、教育、就业、婚姻、生育等，也是备受关注的问题。 因此，癫痫不仅是医疗问题，也是重要的公共卫生和社会 问题。
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P-糖蛋白与癫痫耐药
一、癫痫定义
概念性定义 癫痫是一种以具有持久的致痫倾向和 相应的神经生物、认知、社会心理等方面后果为特 征的脑部疾病(2005年，ILAE和国际癫痫病友会)。
一、癫痫定义
实用性定义(新) 癫痫是一种脑部疾病，符合如下任何一 种情况可确定为癫痫：1、至少2次间隔＞24h的非诱发性 (或反射性)发作；2、一次非诱发性(或反射性)发作，并 且在未来10年内，再次发作风险与两次非诱发性发作后的 再发风险相当(至少60%)；3、诊断某种癫痫综合征。符合 以下任何一种情况，可以认为癫痫已不存在：1、已经超 过了某种年龄依赖癫痫综合征的患病年龄；2、已经10年 无发作，并且近5年已停用AEDs (2014年，ILAE)。(吴立 文，等.解读新的癫痫临床实用性定义，中华神经科杂志， 2014)
☞ABCB1基因C3435T位点SNPs可影响癫痫患者
脑脊液中P-gp水平，即携带CC基因型的癫痫患 者P-gp高表达，发生癫痫耐药的风险增加。
④临床意义 ☞P-gp在癫痫耐药中可能扮演着重要的作用， 为耐药性癫痫药物治疗提供重要的信息，如 研发非P-gp底物的AEDs，绕过P-gp的作用机 制，也可研制P-gp抑制剂，降低癫痫患者BBB 中P-gp的表达，提高致痫灶中的AEDs的药物 浓度，以达到控制癫痫发作。
☞ P-gp功能 其基本功能是作为一个能量依赖性运输泵，
将来自大脑的多种有害物质逆浓度梯度转运至细胞外，减少
其在大脑中的蓄积，减轻细胞毒作用。
☞ P-gp底物 其底物具有亲脂性并带有阴离子，在膜上有 较长的停留时间，可被其转运，如PB、CBZ、PHT和LTG等陆 续被证实为P-gp的底物，影响其在体内的吸收和分布。尚无 证据表明LEV是P-gp的底物(Potschka H,et al.)。 ☞ P-gp抑制剂 抗生素类(利福平)、免疫抑制剂(环孢素A)、 钙拮抗剂(维拉帕米)等。
二、流行病学资料
1、全球患病情况 WHO调查显示癫痫的患病率约 5‰～7‰，目前全球癫痫患者超过5000万。 1 2、国内患病情况 王文志等调查报道，目前国内 约有癫痫患者900万，其中600万左右为活动性癫痫； 国内癫痫年发病率约28.8/10万，每年新增癫痫患 者约38万；其中宁夏患病率约8.5‰，居全国之首。 3
30.65±8.40 28.72±6.08
0.76±0.24 0.64±0.18
t值
2.715
1.820
2.088
P值
0.008
0.070
0.042
ABCB1 C3435T电泳图
目的基因条带(231bp)电泳图 A为Marker；B：B及右侧条 带均为PCR产物。
野生纯合型(CC)：163bp和68bp两条带；突变型(TT)： 231bp一条带；杂合子型(CT)：231bp、163bp和68bp三条带。 A：DNA Marker；B：CC型；C，D：CT型；E：TT型。
四、P-gp与癫痫耐药的相关研究
1、P-gp与结构、功能及编码基因 ☞ P-gp的结构及分布 P-gp是一个磷酸化和糖基化的能 量依赖性跨膜外向转运蛋白，其分子量为170KD(包含 1280个氨基酸)，由12个疏水跨膜区和两个胞内三磷酸腺 苷(ATP)结合点组成，ATP结合点为底物转运提供能量。 P-gp主要位于毛细血管近血管腔一侧和毛细血管外星形 胶质细胞足突上，参与构成BBB。
☞ P-gp的编码基因 ABCB1基因位于7q21.1，全
长大约100kb，包含29个外显子和28个内含子，超过 50个单核苷酸多态性(SNPs)。其中位于12号外显子 的T1236C、21号外显子的G2677T/A、26号外显子的 C3435T，是研究其与癫痫耐药相关性常用的位点。
P-gp二级结构模式图 P-gp的12个跨膜区在细胞膜上形 成一个三维的桶状结构。小圆圈内（箭头）标注了常见的 SNPs所在位置，灰色圆圈标注的区域为ATP结合部位(LI Yan-Hong,et al.)。
③神经网络重组学说 认为通过基因、神经递质或微环 境的作用引起神经元变性坏死和胶质细胞反应性增生， 残留神经元在错误信息的指导下向着非生理方向延伸， 与下位突触形成异常连接，形成了病理状态下的兴奋性 为主的神经环路，增加了发作的敏感性，并可避开一些 重要的药物作用和生理屏蔽，导致癫痫耐药。
④疾病自身严重性学说 耐药是与疾病自身严重性 相关的固有特性，由疾病本身的病因学、病理改变所 决定。如皮质发育不良本身有轻、中、重之分，直接 决定其临床疗效。不同的癫痫综合征其严重性不同， 如伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫(BECT)——正规抗 癫痫治疗预后良好；不典型儿童良性局部性癫痫 (ABPE)为BECT变异型——难以控制，预后不佳，常遗 留轻至中度智力缺陷。
2.361 0.097
脑脊液与血清中 P-gp浓度比值
0.62±0.19 0.68±0.24 0.62±0.18
0.709 0.495
③结论 ☞癫痫患者脑脊液中P-gp的高表达与癫痫耐药 关系密切。耐药性癫痫患者脑脊液中存在P-gp 高表达，可能阻碍了AEDs透过BBB，降低脑组 织内的药因型患者P-gp浓度及比值比较
基因型 n
CC型 58 CT型 92 TT型 28 F值 P值
脑脊液中P-gp浓 度
(ng/ml) 19.60±4.10
18.89±5.48 16.46±3.52
3.385 0.025
血清中P-gp浓度 (ng/ml)
31.54±9.34 28.92±6.16 29.01±7.25
三、癫痫耐药机制
☞癫痫耐药目前缺乏统一定义，并且耐药概念尚有争议。 ☞2010年ILAE将癫痫耐药定义为：2种正确选择、可耐受 的抗癫痫药物经足够疗程及剂量的单药或联合用药仍未能 控制发作的癫痫。 ☞有学者(Bodet R,et al.)认为，除对第一种抗癫痫药物 耐药外，对随后连续多种单一药物或联合用药治疗均无效， 并且排除假性耐药后即可诊断癫痫耐药。
③癫痫患者 用逆转-聚合酶链反应(rt-PCR)定量 分析了19例难治性癫痫患者手术切除的脑组织标本，
其中11例样本的ABCB1 mRNA表达水平高于正常值10
倍以上 (Tishler,et al.)，致痫灶周围组织细胞 的P-gp表达是邻近组织的1.3～2.0倍(Kannan P,et al)。
☞癫痫耐药机制复杂，仍不十分清楚，主要有以下四种学 说： ①多药转运体学说 在BBB上有多种多药转运体，如P-糖 蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、主穹窿蛋白(MVP)、 乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等，其功能是阻止可能有害毒性分 子进入脑组织。AEDs要想发挥疗效就必须透过BBB，当这 些转运蛋白表达增加或活性增强时，可阻止AEDs穿过BBB 到达脑组织，降低AEDs在致痫灶的有效浓度。